一、
最近我们实验室想做这个试验,以前也没有做过,如果有战友做过这个试验,希望介绍点经验和教训,谢谢了。应战友要求,在网上找了一下基础资料,方便大家查看,虽然下面也列出了试验方法,但在实际实验室可能并不一样,希望战友们较少些自己的亲身体会,让大家和我本人在即将进行的试验中少走弯路。先谢谢各位了。
免疫共沉淀
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为:
1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;
2. 蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;
3. 可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点为:
1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;
2. 两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;
3. 必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
实验流程为:
1. 转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, 最大转速离心30 min后取上清;
2. 取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;
3. 取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;
4. 将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;
5. 免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;
6. SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
注意的问题:
1. 细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。
2. 使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用
3. 使用对照抗体:
单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体:正常兔IgG
在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:
1. 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;
2. 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;
3. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。
二、
ChIP是个很郁闷的实验,时间花费N长,如果做的不好非常打击人,我也谈不上什么成功经验呢:
1. 显然抗体来源要可靠,很多在WB上很好的商业化抗体并不能成功使用到ChIP上。
2. 超声处理要充分,处理完呢以后DNA一定要跑胶检测看看,如果片段都很大,结果受到的影响很大,特别是如果ChIP组蛋白。
三、
ChIP是ChIp(染色质免疫沉淀),不是楼主说的Co-IP(免疫共沉淀),二者是风马牛不相及的两个试验和概念,原理和目的都不一样,楼上很多人将二者搞混了。染色质免疫沉淀的作用是鉴定蛋白与DNA的结合,相当于EMSA(凝胶滞留试验)的体内试验。
基本原理是用抗体将目标蛋白及其它可能结合的DNA沉淀下来,然后用引物扩增DNA的序列。因此这个目标蛋白通常具备转录调节功能,能够结合DNA,目前也有做结合RNA的Chip。免疫共沉淀的作用是鉴定蛋白与蛋白的相互作用。用抗体将蛋白(A)及其可能结合的目标蛋白(B)沉淀下来。因此这个A蛋白可以是任何蛋白。“共”指反过来用B的抗体也能将A/B复合物沉下来。如果是单向的,通常叫免疫沉淀。
四、
我做的不是很多,但是有几点提出来和大家讨论下。我想这个试验最关键的就是细胞的处理和抗体来源。如以上所说,的确很多WB的抗体是不一定可以用到ChIP上的,这个应该是和抗体的制作过程有关系的。至于多抗还是单抗,我认为各有优缺点。
比如说单抗是特异性的针对某种表位的,这样可以选择几种单抗混合使用效果会好些,而且背景也低很多。多抗虽然比较复杂,最主要的是非特异性反应比较多,导致试验结果不好判断,但是经过合理的纯化,应该会将这个缺点变小。
做ChIP的抗体应该是能够针对空间表位的,虽然某些针对线性表位的抗体也能够运用其中,但是那只是小部分,所以我认为抗体的来源很关键,无论是购买还是自己制作,都需要对其的特性比较了解。
ChIP还有一个问题是细胞的处理,虽然很多公司都提供了现成的试剂可供选择,但是那只是通用性的试剂,真正适合自己细胞的还需要做预试验摸索下。其次是细胞内相互作用的蛋白,可能会由于处理导致不发生作用等等因素导致相应值变低,所以我觉得处理时间,温度等等外部条件还是很重要的。以上是个人观点,仅供参考!