推荐:细胞冻存步骤的专业实验流程

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关键词: 细胞冻存 步骤

来源: 互联网

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我们知道,在细胞培养 检测实验在实验仪器、培养基等等工作上都要耗费不少的人力和体力。好在很久以前就有高人发明了细胞保存这个实验步骤,将暂时多出来的细胞冰冻保存,以最大程度保存细胞活力。

一、细胞冷冻保存

1. 材料:

生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO (Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0. 4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)

2. 冷冻保存方法:

(1)传统方法: 冷存管置于4 ℃10分钟--->-20 ℃30分钟--->-80 ℃ 16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。

-20 ℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80 ℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

(2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3 ℃/分钟之速度由室温降至(-80 ℃以下)-120 ℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

3. 步骤:

(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。

(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜 (DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。

(3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0. 1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

(4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2 ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。

4. 注意事项:

(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。

(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0. 22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10 ml小体积分装,4 ℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。

(4)冷冻保存之细胞浓度:

①normal human fibroblast:1~3×106cells/ ml

②hybridoma:1~3×106cells/ ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

③adherent tumor lines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ ml

④other suspensions:5~10×106cells/ ml,human lymphocyte须至少5×106cells/ ml。

(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。

(6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。

二、冷冻细胞活化

1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。

2. 细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。

3. 材料

37 ℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器

4. 步骤:

(1)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。

(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。

(3)将新鲜培养基置于37 ℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。

(4)取出冷冻管,立即放入37 ℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。

(5)取出解冻之细胞悬浮液,缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:10~1:15),混合均匀,放入CO2培养箱培养。取0. 1 ml解冻细胞悬浮液作存活测试。

(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异,一般而言,大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除,则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml培养基之离心管内,离心1000 rpm,5分钟,移去上清液,加入新鲜培养基,混合均匀,放入CO2培养箱培养。

(7)若不需立即去除冷冻保存剂,则在解冻培养后隔日更换培养基。

三、细胞计数与存活测试

1. 原理:

(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。

(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个1 mm2大正方形,其中4个角落之正方形再细刻16个小格,深度均为0. 1 mm。当chamber上方盖上盖玻片后,每个大正方形之体积为1 mm2×0. 1 mm=1. 0x10-4 ml。使用时,计数每个大正方形内之细胞数目,乘以稀释倍数,再乘以104,即为每 ml中之细胞数目。

(3)存活测试之步骤为dyeexclusion,利用染料会渗入死细胞中而呈色,而活细胞因细胞膜完整,染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料,如果细胞不易吸收trypan blue,则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率:活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成,随时间延长,部分活细胞也开始摄取染料;因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力,用不含血清的稀释液,可以使染色计数更为准确。

2. 材料:

0. 4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0. 1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0. 05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100 mlCa++/Mg++freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜;粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)。白细胞稀释液(4%乙酸溶液)。

3. 步骤:

(1)取50 μl细胞悬浮液与50 μl trypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1. 5 ml小离心管中。

(2)取少许混合液(约15 μl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入,盖上盖玻片,于100倍倒立显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。

(3)计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue等体积混合),最后乘以104,即为每 ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。

注:4大格细胞总数×稀释倍数×104/4=细胞数/ ml;每一大格的体积=0. 1 cm×0. 1 cm×0. 01 cm=10-4 ml

计数板计数时,最适浓度为5~10×105细胞/ ml,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液,可取出部分作稀释或连续稀释后计数。

4. 范例:

T75 monolayer culture制成10 ml细胞悬浮液,取0. 1 ml溶液与0. 1 ml trypan blue混合均匀于试管中,取少许混合液加入血球计数盘,计数四大方格内之细胞数目。

活细胞数/方格:55,62,49,59;死细胞数/方格:5,3,4,6;细胞总数=243

平均细胞数/方格=60. 75;稀释倍数=2;

细胞数/ ml:60. 75×104×2(稀释倍数)=1. 22×106;

细胞数/flask(10 ml):1. 22×106×10 ml=12. 2×106

其实理论上讲处于细胞增殖期之前的细胞都可用于冻存,不过如果想要更好的效果,最好是取对数生长期的细胞,并注意做好冻存前的换液工作。温馨提示,从冻存管将细胞放入或取出时,都好做好保护工作,以免受冻。

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