关键词: 噬藻体 流式细胞术 计数
来源: 贝克曼库尔特
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实验简介
噬藻体是水体中常见的浮游病毒,具有控制有害藻华、调节水生态结构、以纳米尺度驱动全球生物地球化学循环、特别是碳循环的一类不可忽视的战略生物资源;异弯藻是水体中的常见藻类,在适宜的温度下会大量生长,曾在大连湾、胶州湾等曾多次形成赤潮,对异弯藻计数是水质检测中常见的检测项目。
异弯藻富含叶绿素,叶绿素在蓝光激发下有红色自发荧光;检测水体中大肠杆菌的含量,常作为水体污染指数的衡量标准。
本实验用核酸染料 SYBR green I 染色,借助 CytoFLEX 流式细胞仪对噬藻体、大肠杆菌、异弯藻进行区分,并绝对计数。与传统的显微镜计数及平板菌落计数法等相比,具有速度快,操作简便,结果准确的优点。
材料与方法
▶ 试剂
▶ 样品制备
1. 准备以下四管样本:噬藻体、大肠杆菌、异弯藻、三者混合(用 TE-buffer 稀释);
2. SYBR green I(Invitrogen,母液液为 10000×,DMSO 稀释,-20 ℃ 冰箱保存)。使用 时需要将母液稀释 200 倍使用(超纯水稀释),SYBR Green I 80°避光染色 10 min;
3. 上机检测。
▶ 仪器配置
数据分析
1. 建立 FSC/VSSC-Log 双参数散点图,SYBR /VSSC-Log 散点图用于区分病毒与细菌,PC5.5/VSSC-Log 散 点图用于区分藻类;
2. 将阈值设定在 SYBR 通道,以 SYBR green I 染色的 TE-buffer 作为对照,界定阈值将杂信号去掉;
3. 分别检测以下样本:A:SYBR green I 染色噬藻体、B:SYBR green I 染色大肠杆菌、C:SYBR green I 染色 的噬藻体、大肠杆菌、异弯藻三者混合样本。
实验结果
A:SYBR green I 染色噬藻体
B:SYBR green I 染色大肠杆菌
C:SYBR green I 染色的三者混合样本
CytoFLEX 是第一台借助 VSSC 可检测 100 nm 微颗粒的流式细胞仪,在本次实验中 CytoFLEX 流式细胞仪可通 过荧光信号和 VSSC 对噬藻体病毒进行区分,并以其强大的灵敏性区分 DNA 含量不同的噬藻体与大肠杆菌。 除此之外,CytoFLEX 有自动计数功能,与用户传统方式的计数方式做比较,结果一致。
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细胞污染
悬浮细胞复苏后培养2.3天会出现小黑点,在倒置显微镜第四挡可见细菌在活动。采用两次离心,然后加平时双倍量的抗生素,效果不佳。实验用的东西都重新高压灭菌了,培养液也重新过滤了,个人操作也更加注意了,但仍然在复苏后出现细菌,苦恼!!!
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