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xiaoniao175问:
请问怎样提高细胞的转染效率?我前天做了转染,连接目的基因的载体带荧光,转染后48小时在荧光显微镜下观察,却发现只有约百分之15左右的荧光,我该怎么提高转染效率?有没有必要接着往下做筛选?还是重新转染一次?
丁香园网友dafang0212认为:
如果要是做稳定筛选的话,15%的转染率应该够了。
提高转染效率的话,可以适当降低转染时细胞的密度(我试过60~70%的密度比90%更好一些),另外还有可能就是细胞的生长状态,还有在接种后24h内进行转染。
丁香园网友biologyinsect认为:
转染应该在对数生长期内进行才能保证转染效率,因为该时期细胞生长状态良好,容易吸收外源质粒,而不同细胞株的对数生长期是有差异的,因此建议你先绘制培养细胞的生长曲线、确定其对数生长期,然后再着手做转染。祝你成功!
丁香园网友fangfang2007认为:
我用293细胞包装病毒,转染有荧光(约百分之二十),但是感染老是没有荧光,感染细胞状态很好,第四天后开始变园脱落。转然后的细胞没有抗性,不能筛。迷茫中---请各位高手指点迷津,先谢了!!!
丁香园网友housing456认为:
20%的转染率太低了,我用293T包装慢病毒转染率达到80%以上.转染率太低和293T的代数有关系.还和质粒的浓度和纯度有关系.
转染的前一天将细胞传代,根据你的细胞生长速度,传成适当的密度,保证第二天细胞达到70%左右,做转染。我是用的脂质体转染,由于脂质体对细胞有毒性作用,细胞特别容易脱落,所以防止细胞脱落,是提高转染效率的关键。
丁香园网友seaman_7717认为:
转染的效率根本上还是由细胞种类决定的,有些细胞系好转,效率高,有些就不怎么好了。但是我们还是可以尽可能的提高转染效率,上面的战友讲过,细胞生长状态要好,这个很重要。另外,每种细胞系都有自己的最好用的转染试剂,要多看文献知道这种细胞系用哪种转染试剂最多。然后自己可以按照DNA和转染试剂的比例做个曲线,看看reporter的表达效率,做到最好的转染效率。其实DNA的质量也很重要,不仅仅是内毒素影响细胞的生存,一般情况下DNA超螺旋最好比列越高越好。为了促进表达,转染前线性化也可以(可能是这样,没有这么做过)。
如果有些细胞系确实难转,就应该考虑其他方法了,电穿,病毒之类的。amaxa的nucleofector可以直接把质粒打到核里,很好用。
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细胞污染
悬浮细胞复苏后培养2.3天会出现小黑点,在倒置显微镜第四挡可见细菌在活动。采用两次离心,然后加平时双倍量的抗生素,效果不佳。实验用的东西都重新高压灭菌了,培养液也重新过滤了,个人操作也更加注意了,但仍然在复苏后出现细菌,苦恼!!!
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