关键词: 细胞裂解 western blot 细胞裂解液 细胞
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DXY网友mavisw提问:我用六孔板做细胞转染,转后要做western blot检测,今天裂解转染后的细胞时直接往六孔板的每个孔中加入了400微升的细胞裂解液,收集离心后未见沉淀,不知道用裂解产物做western blot蛋白含量够不够?
DXY网友Pureflat回复:六孔板中加入400微升裂解液太多,这样会使你得到的蛋白浓度过低,满足不了Western blot上样的需要,我第一次做这个实验时,就犯过相同的错误,因为Western blot对一般蛋白的检测均需要上样40 微克,而上样的体积又是有限的,所以提蛋白时应尽可能的使蛋白浓度高。因此,我通常采用的方法是:先弃去培养液,用冰PBS洗3次,然后用细胞刮将细胞刮入1.5 ml EP管中,低速离心,去上清。若是六孔板的一孔细胞,在沉淀中加入80 微升裂解液即可,然后充分吹打,置于冰上裂解15 min,离心。但是,我觉得有无离心沉淀跟你加入的裂解液体积无关,离心需用12000 rpm × 5 min,不知你的转速达到没有,先测测蛋白浓度再说吧。如果你的样品比较珍贵,可以考虑用Mini型蛋白浓缩柱进行浓缩,我以前见过的最小Mini柱的规格是5 ml的,对你不适用,但是现在有1 ml的Mini柱。
DXY网友juventus2004回复:六孔板最多加200微升裂解液,可以用细胞刮,先低速后高速,高速我采用4度12000转15 min,其实在整个过程中温度很重要,我习惯把所有物品提前置冰块中,在放入4度冰箱,然后拿出实验,而且我在取细胞也在冰上,配裂解液临用临配,而且在冰上配,将EP管置于冰中,裂解我也是把离心管置冰中,然后塞入4度冰箱,15 min。
DXY网友xulees提问:可否告知你们用的细胞裂解液的配方?我想用它们裂解细胞后测一下酶(酸性磷酸酶)的活性,不知道这有影响吗?
DXY网友Pureflat回复:我裂解蛋白是用来做western的,那么裂解液里面就需要加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂,而你测的刚好是碱性磷酸酶,因此不能使用一般的western细胞裂解液。我的western细胞裂解液配方如下。你删去其中的蛋白酶和磷酸酶抑制剂就可以用了。20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4150 mmol/L NaCl1% Triton x-1000.1% SDS1%脱氧胆酸钠1 mmol/L EDTA (蛋白酶抑制剂)1 mmol/L PMSF(蛋白酶抑制剂)1 μg/ml aprotinin(蛋白酶抑制剂)1 mmol/L Na3VO4 (磷酸酶抑制剂)另外,如果你们实验室有超声破碎仪的话,我还有一种更简单的建议方法,我测细胞中的葡萄糖醛酸转移酶是这样破碎细胞的:弃去旧的培养液后,用冰PBS洗3次,然后用Ep管低速离心,去掉大部分上清,重悬细胞,然后超声(将超声转头伸入细胞悬液中)1 min ×2 次,2次之间间隔30 s,这个操作最重要的就是低温,因为超声时产热量大,需将Ep管插在冰上进行超声,间隔30 s也是这个原因。
DXY网友xulees提问:蒙Pureflat战友指点,实在非常感谢!它们对我都是非常有用的资料!我还有几个个小问题:Pureflat 你在测细胞的葡萄糖醛酸转移酶时,是不是先把细胞养至贴壁再测?还是从组织块得到分散的细胞而测定?你用PBS洗时的离心转速是多少?
DXY网友Pureflat回复:我养的细胞本身就是贴壁细胞,所以是在其中加入药物后,用细胞刮刮下来的。如果你需要测组织中酶的活性就更简单了,可以直接用匀浆器对组织匀浆,测定蛋白含量,然后加入酶的底物。细胞用PBS洗涤时用的是1000 rpm x 5 min。
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你所在的学校的补助在全国是什么水平?
还记得你在读研时,所在学校的补助是多少吗~?读博的也可以说说呀。我的好少,有点想哭。
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科研汪也想有春天:告诉我你们的另一半都在哪里找的?
小伙伴们,请问你们的女(男)朋友是怎么找到的?(好给后来的朋友参考啊)是交友网站,还是七大姑八大姨介绍,还是同学自然成事?春天到了,我也想拥有一段甜甜的恋爱~看看你们可怜又可爱的小师弟小师妹吧!
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细胞污染
悬浮细胞复苏后培养2.3天会出现小黑点,在倒置显微镜第四挡可见细菌在活动。采用两次离心,然后加平时双倍量的抗生素,效果不佳。实验用的东西都重新高压灭菌了,培养液也重新过滤了,个人操作也更加注意了,但仍然在复苏后出现细菌,苦恼!!!
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