求助高人啊,我想用斑马鱼整体胚胎检测其细胞凋亡情况,选用的Roche的in situ cell death detection kit, POD. 按照其中的贴壁细胞或细胞涂片的方法做了两遍,可是连阳性对照都没有信号。后来查找到一篇论文中的方法,如下:
a,收集胚胎后用PBS清洗,转移到1.5ml的EP管内,4%多聚甲醛PBS固定过
夜
b,用PBS配制 25%50%75%的梯度酒精,每次5min将胚胎梯度脱水。
c,用-20度预冷的丙酮冷冻固定10分钟
d,PBS清洗 10minX2
e,用新鲜配制的通透液(含0.1%的Triton X-100和0.1%的柠檬酸钠溶液)
室温通透15min。
f,PBS清洗 10minX2
g. 阳性对照组加入DNase I 40ul(1u/ul),37度孵育15min
h. PBS清洗 10minX2
i. Roehe试剂盒中的的TUNEL反应缓冲液(含FITC标记的dUTP)和脱氧核糖
核酸末端转移酶在冰上混合后加入。
j. 4度孵育过夜后放37度30min
k. PBS清洗终止反应,荧光显微镜观察。
可是还是连阳性对照都没有信号。
请问,哪位做过,指点一下吧,谢谢。
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