关键词: DNA ladder 检测 细胞凋亡
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发生细胞凋亡时,内源性核酸酶被激活,染色体DNA链在核小体之间被切割,形成180~200个碱基或其整数倍的DNA片段,将这些DNA片段抽提出来进行电泳,可得到DNA梯状条带(DNA ladder)。
一、材料与试剂
凋亡细胞;
蛋白酶K(500μg/ml)
8mol/L 醋酸钾
白细胞裂解液:pH8.0,10mmol/L Tris-HCl,10mmol/L NaCl,10mmol/L EDTA,1% SDS。
氯仿
无水乙醇,70%乙醇;
2%琼脂糖凝胶。
二、操作步骤
1. 收集凋亡细胞:取1~2×106 个细胞,离心后,立即用70%酒精(-20℃)固定2h;
2. 洗涤:取出酒精固定的细胞,1000r/min离心5min ,去掉上清液,PBS洗二次;
3. 裂解细胞:加400μl细胞裂解液,充分混匀再加蛋白酶K100μl,置65℃水浴消化2小时或过夜;
4. 蛋白处理:加75μl 8mol/L的醋酸钾,4℃15min,再加750μl氯仿,充分混匀后,10000r/min离心10分钟后,将上清移至一新的Eppendorf管中;
5. 沉淀DNA:加入750μl无水乙醇,上下轻柔颠倒混合,即可见乳白色沉淀,若不明显时可置-20℃过夜,12000r/min离心10分钟,去上清;
6. 洗涤DNA:加1ml70%乙醇,混匀,10000r/min 离心5min,去上清;
7. 溶解DNA:根据 DAN 沉淀的大小,加一定量的蒸馏水或TE,37℃溶解;
8. 测定DNA浓度;
9. 2%琼脂糖凝胶电泳80V 2小时;
三、结果判断
出现梯状电泳条带,最小的条带为180~200 bp,其他的条带为其整倍数大小。坏死细胞则出现弥散的电泳条带,无清晰可见的条带。正常细胞DNA基因条带因分子量大,迁移距离短,故停留在加样孔附近
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细胞污染
悬浮细胞复苏后培养2.3天会出现小黑点,在倒置显微镜第四挡可见细菌在活动。采用两次离心,然后加平时双倍量的抗生素,效果不佳。实验用的东西都重新高压灭菌了,培养液也重新过滤了,个人操作也更加注意了,但仍然在复苏后出现细菌,苦恼!!!
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