细胞培养注意事项(入门级)

细胞培养注意事项(入门级)

关键词: 细胞培养注意事项(入门级)

来源: 丁香园

2019-03-21 6820 阅读

总的原则:无菌操作、保证细胞培养环境的稳定性

按时间顺序整理

1、  细胞房和生物安全柜(或超净工作台)先开紫外照射30min。作用:对环境灭菌(空气)。(备注:如果着急,至少也要开15分钟)

在做实验之前考虑好需要哪些物品。开始照射之前,将所需要用到的物品都放到生物安全柜(或超净工作台)里面。

常用移液枪或电动移液器等,需要在工作台上放置一套专用设备。

细胞培养箱一般都已经调整好。定期留意一下二氧化碳是否足够。不够及时更换。


2、  显微镜需要定期消毒酒精擦拭。注意:显微镜一般都放在细胞房。


3、  进入实验之前,首先给自己带上拖鞋、头套,口罩,实验服,手套(手套带双层)。注意:手套要将袖口套进去。实验服、拖鞋最好是细胞房专用。


4、  开始操作之前先观察细胞。

首先观察细胞培养液的颜色。现在的细胞培养液通常都放有酸碱指示剂(绝大部分是酚红)。细胞在培养生长过程中,不断在培养液上清中累积酸性物质,时间长了,培养液变为黄色(同时培养液中营养物质耗尽)。

其次镜下观察细胞的生长状态是否良好,是否需要传代。如果生长状态不好,需要对培养液进行调整(一般是加大血清浓度)。过于密集出现大片融合或太密集而导致细胞脱落,则进行传代。

如果长势良好,且细胞培养液颜色未发生变化,可以酌情进行1/2、 1/3、1/4换液,也可以全换液。总之,视细胞生长情况而定。


5、  细胞培养预准备:

首先是准备各种溶液。

第一是配制溶液过程中要用到的水。水用纯水,高压灭菌之后,再去内毒素。去内毒素方法很多,最简单可以放在烘箱180度3小时。或者过去内毒素的柱子后,高压灭菌。

第二,各种溶液灭菌:

抗生素用去内毒素水配制后,直接过滤除菌(过0.22u滤头)。可以用一次性无菌注射器过一次性0.22u滤头。

现在用的培养液,如果是商业化液体培养基,不用处理。如果是粉末,需要用去内毒素水在生物安全柜(或超净工作台)进行配制,再过滤除菌。可以先配浓缩液(如10×),过滤除菌后。再用灭菌去内毒素水稀释成1×培养液。

第三,完全培养液的配制:

培养液加上合适比例的血清即可。但血清一般保存于-20℃,一般解冻是放在4℃冰箱解冻,耗时长,而且必须解决完全之后,才能进行完全培养基的配制。所以要提前几个小时就将血清从-20℃转入4℃,以期完全解冻。当然如果这一次就需要用完的话(是指用这些血清配制的培养液都用完),也可以放到37℃解冻。

第四,最重要的是保证过程中无菌。

液体必须要分装。无论过程中用到的培养液、胰酶、血清、PBS、生理盐水、抗生素尽量分装。分装是为了防止污染。如果操作有误,仅能威胁到其中一支,而非整个。

培养液、血清、PBS、生理盐水分装为20mL、50mL或100mL/管

胰酶、抗生素可分装为1mL/管。

分装最好先于细胞操作

第五,操作之前,培养液先放到37度的细胞培养箱里复温。原因:尽量减少对细胞的刺激。低温对于细胞也是一个刺激因素。

第六,操作之前,大脑先过一遍此次操作所需要用到的所有用具。将所有用具先放到无菌台面上。减少拿入拿出的动作,保证无菌。(如果万一发现少拿了什么,也不要紧,再加上就是。如果是枪头盒、移液管等用具,最好先用消毒酒精喷一下)。

第七,操作之前,带着的手套先喷消毒酒精。然后再进入工作台。等一分钟,等手套上的酒精挥发之后再进行操作。


6、  细胞培养操作过程:

注意无菌。无论哪一管液体,开盖后尽量立即关上(如果有几瓶都需要开的,也注意,可以虚盖)。盖子向上放。操作时不要从开盖的容器上方经过。另外,无菌台面上摆放的各种东西,最好是一字摆开,平行于自己。尽量不要前后重叠。

细胞操作中所用的所有耗材试剂最好都是细胞培养专用。一般都以一次性耗材居多。1ML枪头为加长型专用培养枪头。移液管亦有专用10mL一次性无菌移液管

(1)细胞换液:

培养皿/瓶用枪头或移液管吸去原培养液,加入新培养液。

(2)细胞传代:

传代之前先观察,细胞是否密集,是否开始融合。一般融合达到70-80%就可以传代。早点传代也可以。

如果是贴壁生长的细胞:

1)  培养皿/瓶用枪头或移液管吸去原培养液;

2)  无菌PBS或无菌生理盐水洗涤3次(按培养体积加入);

3)  加入适量胰酶消化适当时间(一般胰酶为0.25%;9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶,一次加入1mL胰酶。消化时间视细胞类型等多种情况综合考虑,一般如果是细胞株,非原代培养,消化1-2分钟足矣);

4)  用枪头吹打数十次(视细胞类型而定。一般细胞株30-50次吧,耗时一般2分钟左右);

5)  加入适量体积完全培养基终止胰酶消化(如果是9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶,可以加入1mL完全培养基;现在培养瓶(皿)里有2mL溶液)。

6)  现在可以将溶液进行分瓶(2mL)。如果是细胞株,直接均分到两个培养瓶(皿)里。如果是原代培养,可以根据消化时间来对细胞进行分离;因此可以将溶液(2mL)都转入新的培养瓶(皿)。

7)  将两个培养瓶(皿)补足完全培养基到正常体积(果是9cm/10cm培养皿和25cm培养瓶,为5mL完全培养液)

8)  镜下观察。刚刚传代细胞还没贴壁,悬浮在溶液中,呈圆形。一般2h之内会贴壁,如果已经贴壁,根据细胞类型有不同的形态,但通常都不是圆形。

9)  镜下观察无误之后,再放入细胞培养箱。培养瓶(皿)放入之前,可以用消毒酒精先擦一下。

10)  传代之后,最好第二天细胞换液一次。当然,也可以视情况而定。


7、  收拾工作台。物品归位,倒出垃圾。再开紫外照射30min


8、  其它注意事项:

第一,经常观察。最好是每天都显微镜下看一看,确定细胞状态。然后该换液换,该传代传,不用理会的就原样放回去。如果好几天都不想理会,可以放不完全培养基,或者低血清浓度的培养液,维持细胞生存,但不增殖。

第二,是否加抗生素。这个视情况而定。细胞培养过程中,是要求尽量少添加不相关的杂质。抗生素对于细胞来说,也是一种负担。但如果环境比较污染,直接添加好了。好比没病不用吃药,感冒了还是要吃药;婴儿没病但还是要打疫苗。

第三,胎牛血清的解冻。血清一般保存于-20℃,要放在4℃冰箱解冻,耗时长,500mL要好几个小时,我们经常是头天离开实验室之前放到4℃冰箱,过夜。所以经常分装成10mL或者20mL。这样,上午放到4℃冰箱,下午就可以用了。

第二,是否一定要细胞房。以及是否要完全严格的遵守种种器具专用。这个吧,见仁见智。凡所有种种措施及设备都是为了保证培养操作过程中无菌,减少感染的机率;专用试剂耗材保证无菌无内毒素。细胞房也是这么一个措施而已,其它试剂耗材也是;我们没有专门的细胞房也这么养。

并不是说走夜路就一定会遇到鬼,当然走多了迟早遇到,如果总是遇不到,这个人运气一定很好——可以去买彩票。

刚开始我们实验室也是没有专用的生物安全柜和细胞房,拖鞋什么的也没办法专用,没有加抗生素,照样养得好好的。但是,交叉养,还是需要注意,一是时间上分隔开来:每天细胞培养先操作。其它细菌之类操作靠后,且操作后消毒酒精台面消毒,紫外照射1小时。二是其它操作要小心,避免带入污染。当然,如果有必要加抗生素,还是尽早加,比细胞污染了再去抢救要来得好。

(算是顺便整理了一下,属于入门级别的。)


@geraldorjerry:你好,你的意思是紫外线照过之后,实验操作开始了,如果万一发现少拿了什么,就直接酒精喷一下再放进去是吗

@llh1245:有时确实是忘记,最怕的就是那种实验已经做到一半忘记了的,或者发现东西不够用的。我们一般是这样处理:耗材、移液枪还有金属器皿之类的,可以喷一下酒精放进来,等酒精风干一下,注意不要和其它东西混杂。反正一般细胞专用的也有外包装,里面已经是无菌无内毒素。如果是试剂,那就是直接从冰箱拿出来放进来就是。(如果只是实验还没有真的开始,把漏掉的东西加上,再照30分钟就是。)


@姚丽佳:请问传代前,经过胰酶处理后,加了培养基后不用离心直接分瓶吗?那后面培养的时候不就含有胰蛋白酶了吗?不会产生影响吗?

@llh1245:是的,不用离心直接分瓶。之后加入含血清的培养基中止了胰酶作用。如果是贴壁细胞,一般第二天就贴壁了。分瓶后第二天再全部换液。如果是半悬浮细胞,一般都不用胰酶消化,都是直接吹下来。

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