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骨髓间充质干细胞(MSC)原代培养与传代培养

关键词: 骨髓间充质干细胞 原代培养 传代培养 2009-10-06 00:00 来源:互联网 点击次数:19864

准备工作


(1)试管、试管架、滴管、吸管、小鼠固定架、玻璃瓶、玻璃皿、烧杯、橡皮头、剪刀、镊子、纱布、棉球、酒精灯、滴管、移液器、细胞计数器、生理盐水、PBS、双抗(青链霉素)、75%酒精、95%酒精、培养瓶(50ml,260ml)。


(2)BALB/C小鼠(4~5周龄,18~22g,雌雄不限)、胎牛血清(灭活)、DMEM-LG培养液(美国GIBCO)


(3)针头与注射器:4.5号、7号针头(冲小鼠股骨、胫骨和肱骨骨髓,制单细胞悬液)。



实验前准备


(1)实验室消毒,隔离衣消毒,小鼠固定架消毒。配10%FBS培养液,加双抗(内含青霉素、链霉素各100μg/ml)。


(2)用75% 酒精擦拭无菌操作台面,取各种已消毒的培养用品置于超净台面,无菌室及超净台用紫外灯照射30~60 分钟灭菌。


(3)开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。穿隔离衣,戴手套。用70% 酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风机运转10 分钟后,才可开始实验操作。点燃酒精灯,安装吸管帽。



实验步骤


(1)BALB/C纯系小鼠脱臼处死后,75%乙醇浸泡5min后,在无菌操作台上无菌条件下分离双侧股骨及胫骨,在含生理盐水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周围肌肉组织,剪去包括骺板在内的两侧骺端,用10ml注射器(配4.5号针头)抽取适量含10%FBS的完全培养基冲洗骨髓腔,将骨髓冲入培养瓶。依次用7号针头和4.5号针头(或依次过21、23、25号)反复吹打骨髓细胞悬液,制成单细胞悬液。细胞悬液在1000rpm离心5min后收集细胞或进行密度梯度离心。


(2)将单细胞悬液于1:2比例加到含1.082比重Percoll细胞分离液的离心管中,4℃条件下,经500g密度梯度离心25min,小心收集离心液界面上乳白色云雾状的单核细胞层,加入等量无血清培养基或磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤(500g离心5min或180g离心10min)2次,去上清,用10%FBS的培养基悬浮细胞(用0.83%氯化胺破碎红细胞,培养液重悬细胞)。注意:密度梯度离心力500g×30min组优于800g×30min。本步骤可以省略。


附:人骨髓:抽取骨髓10-15ml(或正常人手术肋骨取骨髓3-5ml),每毫升骨髓加100u 肝素抗凝,充分混匀后,保存于4℃冰箱,24小时内分离骨髓MNC。骨髓先加入等量 PBS或Hanks液(或培养液)混匀后,以1份淋巴细胞分离液上面加2份稀释骨髓的比例,将稀释骨髓缓慢加入ficoll液面上(密度1.077),水平离心机20℃条件下500g(2000r/min)离心25~30分钟。从界面上取出的MNC用PBS液洗涤2~3次后,加适量培养液计数。


(3)数细胞数量,达到106~107/ml后即进行原代培养,按5×106/ml浓度接种于50ml培养瓶中(1×106/cm2培养瓶),每瓶含5ml L-DMEM完全培养液。在体积分数为5%的CO2和37℃条件下静止培养,3d后换液去除非贴壁细胞,以后每3~4d半量换液1次,10~12d细胞达90%融合时传代。


(4)传代培养:传代时先全部吸出培养液后,用无Ca2+ 、Mg2+PBS液洗涤二次,加入37℃预热的0.25%(2.5g/L,0.25%)胰蛋白酶(含1mmol/L EDTA,即用1mmol/L-EDTA-Na2配制)消化1~2分钟,吸去胰酶,以残留的胰酶继续消化,倒置显微镜下观察,细胞开始皱缩时(细胞开始变圆)加入完全培养液(3ml左右)终止胰酶作用。吸管反复吹打后将细胞收集于15ml离心管中,1500r/min 离心10分钟后弃上清,再用PBS液洗涤二次彻底洗去混有的胰蛋白酶。


将细胞再悬浮于培养液中,按2~5×105/ml再次接种传代于新的培养瓶中。当这些细胞生长接近融合层时,即得到骨髓MSC。传至3~5代的MSC按1×105cells/cm2密度接种于放置有盖玻片的6孔板内,以制备细胞爬片。


注:贴壁细胞的消化,应掌握各类型细胞不同的消化时间,避免过度消化,损伤细胞活力;或消化不足,不能充分解离成单细胞。如为长期实验,每个月重新复苏一支细胞,避免长期传代引起细胞特性变异。

编辑: dxy_gak8vis9
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