MDCK细胞培养

关键词: MDCK 细胞培养 实验步骤 2008-08-24 00:00 来源:互联网 点击次数:13045

本人具有数年的细胞培养经验,期间经历了无数次的失败和成功,回想起来有苦也有甜,现在把中国疾病预防控制中心和我自己的经验结合起来,制作成MDCK细胞培养SOP,欢迎大家参阅:

一、目的

MDCK细胞培养是分离流感病毒及相关研究实验的基本技术。疾控中心的所有技术人员,必须按照本文件相关的操作规程进行操作。

二、适用范围

适用于疾控中心所有技术人员 。

三、程序

(一)生物安全要求

实验室生物安全级别:BSL-1

所有操作必须在BSL-1实验室的生物安全柜里进行。

(二)材料

1. 生长成片的MDCK细胞

2. 无菌的T25细胞培养瓶

3. D-MEM培养液(含有L-谷氨酰胺)

4. 青、链霉素母液(10000 U/mL青霉素G;10000µg/mL硫酸链霉素),分装后保存于-20℃

5. HEPES缓冲液,1M母液

6. 胎牛血清

7. EDTA-胰酶(0.05%胰酶,0.53mM EDTA-4Na),分装后保存于-20℃

8. 7.5%牛血清白蛋白组分V

9. 1mL、10mL无菌移液管

10. 70%~75%的酒精

注意事项:经常检查试剂使用的有效期。

(三)实验步骤

这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例,叙述MDCK细胞的培养程序。如果细胞瓶的规格有变,MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。

1. D-MEM培养液的准备

500mL D-MEM液中加入:

青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL青霉素;100µg/mL链霉素),

HEPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)。

7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL

2. 细胞生长液的准备

胎牛血清10mL加到90mL的上述(1)的液体中,使胎牛血清的终浓度为10%。

3. 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去,加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。

4. 温和地摇动细胞瓶1min,使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。然后用移液管吸去EDTA胰酶。

5. 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。

6. 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层,37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离(约5~10min)。必要时可以摇动或吹打来分离细胞。然后加入1mL胎牛血清灭活残余的胰酶。

7. 加9mL已经配置好的含有L-谷氨酸的D-MEM培养液,轻轻用移动移液管来吹散细胞团。

8. 取10mL混合物加到90mL细胞生长液(细胞悬液的浓度大约为每毫升含105细胞)

9. 每个T25细胞培养瓶加入6mL(6×105/mL)细胞悬液,剩余的细胞悬液可以加到T75细胞瓶用于细胞传代。通常6mL细胞悬液2~3日可生长成片(80%~90%)的单层细胞。

10. 于37℃,5%CO2培养箱里培养细胞,每天观察细胞状态,以供进一步实验用。

编辑: dxy_nfu5swte
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