【zhaoqingshan】Goodluck_XD 斑竹的解决方案可能比较费银子。
我也曾遇到过类似的问题,一般来说,原代的时候一定要尽可能的纯,宁可错杀一千,不可放过一个成纤维细胞,否则传代后细胞就会比较杂。所以原代不够纯就放弃。另外,给足生长因子让内皮充分的生长起来。
以前一个老师提供过采用胶原酶的方法,差速消化,不知道是否有效,楼主可以试试,有结果告诉我。另外,有些差速贴壁的方法,好像并不合适,因为内皮贴壁也很快的。
我也是听说的,并不可靠啊,您最好试验一下,就是用0.1%I型或II型胶原酶消化,试试,据说成纤维细胞会先掉下来。要是有结果,一定要告诉我啊!呵呵!
说实话,我养过好几种内皮,就是没有正儿八经的养过HUVEC,帮别人养过几次,纯度还可以(其实消化得好的话,不存在杂细胞的问题的,传2-3代进行实验没有问题的),就是传不了几代。
【tomandmikes】是啊,纯度的问题好说,可以摸索控制时间,但是要不加生长因子等刺激物,仅用培养基和血清,很难多次传代。其实消化后的成纤维细胞不是很多,但见了很烦,我且试试你说的方法。不知道用胰酶可以不可以?
【zhaoqingshan】应该是不可以的,我试过,换低浓度的胰酶也不可以的。内皮和成纤维被消化下来的时间差不多。用ECGF 20ug/ml也不是很贵的,我倒觉得胎牛太贵了。因为我以前养脑微血管内皮用ECGF 150ug/ml。
混合星形细胞
【midas】混合星形细胞的培养
1、取材:取新生4天SD大鼠,颈动脉放血,无菌操作取出 脑组织,切除脑干和海马,解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管等结 缔组织。
2、机械分散:取大脑皮质转移至试管中,并将其快速剪成 1 mm3 左右小块,加适量培养液,用吸管轻轻吹打,使细胞分散,制成细 胞悬液,再经74 um网筛过滤,取滤液,离心,1500r/min, Smin, 重悬细胞,进行细胞计数。
3、细胞计数:台盼蓝:细胞悬液=1: 9染色,在显微镜下计 数。
4、接种与培养:调整细胞密度,以1 X 105/cm`的密度接种于 预先涂有多聚赖氨酸(poly-L-lysine, PLL)的培养瓶中,于培养 箱中孵育30min,翻转瓶并吸出细胞悬液再接种于培养瓶中,以除去成纤维细胞。370C, 5% C0.2培养,每3天换液一次,培养10天。倒置相差显微镜下观察细胞形态细胞,见细胞分为两层:下层是 TIA,上层是0-2A祖细胞。
人胚嗅鞘细胞
【lvranbo1010】 人胚嗅鞘细胞的原代培养
将胚胎头部剪下,浸泡在75%的酒精内3分钟,大量D-Hanks平衡盐溶液冲洗。手术显微镜下,超净台内,迅速完整取出两侧嗅球,置于4℃的D-Hanks平衡盐溶液中,小心除去软脑膜,血管及与其相连的组织。然后用显微器械剪取嗅球最外两层(嗅神经层和小球层,ONGL),再用D-Hanks平衡盐溶液洗3遍。置于含3-4ml DMEM/F12培养基的35mm2培养皿内,将剪取的ONGL组织块用显微器械小心撕开,再用火焰抛光后的移液管小心反复吹打至尽可能小(勿使培养基产生过多的气泡),放入CO2培养箱(5%CO2,37℃)中培养。
人胚嗅鞘细胞的纯化
取材于人胚嗅球的嗅鞘细胞在培养过程中有多种其他细胞,如来自血管、软脑膜等结缔组织的成纤维细胞,以及神经元、星状胶质细胞、小胶质细胞等。其中,成纤维细胞是嗅鞘细胞培养体系中最棘手的污染细胞,其分裂增殖和贴壁速度极快,远远超出嗅鞘细胞的分裂增殖和贴壁速度,且侵蚀面积大。这个特点与动物相似。用于动物嗅鞘细胞纯化的方法很多,有差速贴壁、化学药物法、梯度离心法、免疫亲和吸附法等。目前国内外大多采用阿糖胞苷来达到纯化的目的。但我们参考动物嗅鞘细胞的纯化方法,在不同时间加入1×10-6-1×10-9浓度的阿糖胞苷,每数量级分别培养10次。我们发现,与动物嗅鞘细胞培养过程中阿糖胞苷纯化效果较好相比,人胚的嗅鞘细胞用阿糖胞苷纯化效果极不理想,且嗅鞘细胞数目大大减少。故试验中,我们放弃了阿糖胞苷纯化的方法,而采用了差速贴壁+免疫亲和吸附的纯化方法。根据胎龄的不同,把含有嗅鞘细胞的培养基在CO2培养箱(5%CO2,37℃)中培养12-24小时。培养过程中,每2小时相差显微镜下观察一次。如观察到较多的立体感较强的细胞开始贴壁时,立刻将含有未贴壁的细胞的培养基接种到预先用P75抗体包被的35mm2培养皿内,放入CO2培养箱(5%CO2,37℃)中继续培养。培养36-48小时换液, 祛除未能和P75 抗体结合的细胞。