材料与方法:
材料 :
1.培养皿、培养瓶、烧瓶、试管,玻璃针等。
2.眼科剪、眼科镊、手术刀片。
3.5%CO2孵箱、PH计。
4.恒温水浴箱。
5.RPMi1640培养基,D-Hank’s缓冲液 、胎牛血清,内皮生长因子(ECGF),青霉素,链霉素,戊巴比妥钠等。
方法:
1.取材:4~6wWistar大鼠, 大剂量2%戊巴比妥钠麻醉处死,将处死后的大鼠浸入75%酒精中,放入超净台。在无菌状态下剪开胸腹腔,分离胸主动脉,用2ml注射器从主动脉弓处向胸主动脉注入D-Hank’s液,驱除残血,取主动脉弓至肾动脉一段,两端结扎剪断,放入60℃预热无菌水中2秒。然后置于准备好的RPMi1640培养基(含双抗)中。
2.剪切:在超净台上,将血管置于培养皿中,用眼科镊小心剥离外膜面的结缔组织,并从根部剪去所有肋间动脉。无血清培养基冲洗数遍,去除残血后,将动脉转移至另一含少量培基的无菌培养皿中,用刀片将主动脉两末端切去,剩下的主动脉切成宽1~1.5mm的环。
3.接种:将动脉环竖直放入35mm培养皿(1%明胶4℃预置过夜,用前2h移入CO2培养箱,用前培养液冲洗)中。置CO2培养箱2h后,加入1.5ml培养基。放入37℃,5%CO2培养箱中培养。72h后细胞从环内外生长迁出,环内为内皮细胞,环外为成纤维细胞。将动脉环除去后,可看到内膜面细胞集落与外膜面之间有明显的无细胞区界限,用玻璃针剔除成纤维细胞,得到纯的内皮细胞生长克隆。继续培养10~15d,此时FBS浓度为20%,形成细胞单层。
4.置于5%CO2孵箱中培养,每隔3天换液,培养时添加15% FBS,5~10μg/ml的内皮细胞生长因子(ECGF)以及100μg/ml的肝素。待细胞90%~95%融合时,0.25胰蛋白酶消化传代。
5.内皮细胞鉴定:相差显微镜下,细胞呈单层铺路石状;免疫组化证明有vWF相关抗原存在
6.注意事项:将分离出来的主动脉热处理时温度以60℃2秒为宜,太低则成纤维细胞多,太高或时间久则内皮细胞迁出减少.
【tomandmikes】如果原代培养后,脐静脉内皮细胞和成纤维细胞并存,如何消除后者?尽管通过消化时间的调整可以避免成纤维细胞的存在,但是消化时间过短,收集的细胞数量较少,过长又会增加成纤维细胞污染的机会。
然而一旦污染之后,如何分离纯化内皮细胞呢?有文献报道,可以用消化法,根据消化时间的不同,来筛选内皮细胞,我一知半解,还请高手进来指教。
【Goodluck_XD】Simple, fast and efficient mouse endothelial cell isolation with Dynabeads. Isolated cells are pure and free of contaminating fibroblasts
Introduction
Endothelial cells line the entire vascular system, from the heart to the smallest capillary and control the passage of materials and the transit of leucocytes into and out of the bloodstream. Leucocytes interact with endothelial cells during trafficking, immune responses, inflammatory reactions and haemostasis. A pure population of cells, free from contaminating fibroblasts is required to study endothelial cells. Murine tissue is digested to obtain a single cell suspension. Dynabeads coated with an anti-murine endothelial cell antibody are added directly to the cell suspension and the bead-captured cells are separated with a magnet, Dynal MPC.