【猫耳朵】乳鼠心肌细胞培养
尽量除去杂质细胞:现在一般的做法是:将消化完全的细胞悬液先在大的培养瓶中培养1~2小时,然后再小心的吸出仍然悬浮的心肌细胞,再接种到6孔或24孔板上。这样做主要是尽量除去成纤维细胞。由于成纤维细胞贴壁迅速,而心肌通常在4h后才开始贴壁,这样才能尽量利用差速贴壁法除去成纤维细胞。
【windboy77】乳鼠心肌细胞属于原代生长细胞,培养过程较为繁琐。文献上有多种浓度胰酶消化方法,我们在试验中摸索到0.06%浓度的胰酶对细胞损害较小,比起一些文献记载的0.15%浓度有一定的优越性,但这个浓度消化所需时间较长,所以我们又采取多次反复低浓度消化的方法,每次消化一些后,用吸管抽取出上清液,离心所得即为心肌细胞。利用心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同, 采用差速贴壁1 h, 除去成纤维细胞,达到纯化的目的。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形,中央有卵圆形核,胞质突起,生长时呈放射状。很好和心肌细胞鉴别。
胰岛细胞
【genobody】大鼠胰岛细胞原代培养
一周龄Wistar大鼠,断颈处死,于75%乙醇浸泡15分钟,无菌取出胰脏,于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗,用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织,转入青霉素小瓶中,加入少量无菌D-Hanks液,用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片,用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴,再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次,加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液:0.05g胰蛋白酶(Sigma),0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma,663U/mg),0.05g葡萄糖,溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS(pH值为7.4)溶液,用0.22μm微孔滤膜滤菌],38℃±1℃消化,消化过程中不断震荡,10分钟后吸出上面酶液弃去,用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次,加入新鲜酶液继续消化,重复上述步骤。此时组织块边缘模糊,再将组织块浸入消化酶液中,38℃±1℃消化10分钟,将消化酶液与组织块分开,组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化;而原消化酶液1500rpm离心10分钟,取沉淀即为消化下的细胞,重新用无菌D-Hanks悬浮,离心,重复1~2次,再用培养基洗2~3次,用培养基悬浮即得细胞悬液;将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全,重复以上操作,合并几次所得细胞悬液,计数,调整细胞浓度为2×105个细胞/mL,将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中,每孔1mL,置于37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速,接种15小时后,轻轻振荡培养板,将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中,可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后,换新鲜配置的含有2.5ng/mL的碘乙酸的培养基培养5小时,可除去绝大部分成纤维细胞,而胰岛细胞不受伤害,换不含碘乙酸的培养基洗2次,并换不含碘乙酸的培养基在37℃,5%CO2,饱和湿度培养箱中培养,每隔3天换培养液,获得单层胰岛细胞,
【wangtsy】胰岛的分离与纯化
取新生1-3天SD大鼠10-15只,无菌条件下剖腹取出胰腺置入无菌培养皿中,用眼科剪去除非胰腺组织, 4℃ Hanks液清洗三次后,用眼科剪反复剪切至<0.5mm3组织块,取浓度为1g/L的V型胶原酶溶液5-10ml与之混合,转入三角烧瓶中,于37℃恒温水浴振荡器消化30-40min, 加入两倍体积4℃Hanks液终止消化,用吸管反复吹吸后过80目 筛网,滤液以800rpm低速离心70s去上清液,并用4℃ Hank's液低速离心清洗2次,除去单个腺泡及上皮细胞。加入含2.5mg/L碘乙酸的PRMI1640完全培养基(含10%胎牛血清、10mmol/L HEPES缓冲液、1mmol/L丙酮酸钠、100000u/L青霉素G钾、100mg/L链霉素、71.5umol/L β-巯基乙醇)中制成细胞悬液,接种于75ml玻璃培养瓶中,于37℃,5%CO2,95%空气条件下培养5h后,用无血清培养基低速离心清洗3次,以除去成纤维细胞。然后用正常完全培养基培养24h,转瓶弃去贴壁细胞,用无血清培养液低速离心洗涤两次,沉淀物即为纯化胰岛。再用PRMI1640完全培养基养吧,可长成胰岛单层细胞。
内皮细胞
【benn】看到园子里有好多同仁培养大鼠主动脉内皮细胞,我也在做内皮细胞培养,现在看到一种新的大鼠主动脉内皮细胞的培养方法,正在摸索中,说出来与大家讨论.