重组质粒构建

重组质粒构建

关键词: 重组 质粒 构建

来源: 互联网

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重组质粒构建是常用的分子生物学手段,其实只是最基本的方法,一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。


在国内先进的实验中,也大都是由实验员搞定。但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。在这里将我的心得分享于大家,这也是我本人几年来一线工作时的经验积累,以期能为谷友提供借鉴,让大家在实验中少走弯路。


所涉及内容如下:


1) 克隆基因的酶切位点问题


2) 载体酶切的问题


3) 连接片段浓度比的问题


在阐明上述问题同时,本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。


一、克隆基因的酶切位点问题


1、克隆位点选择的问题。首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析,列出其所含酶切位点清单。然后对照质粒多克隆位点,所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。这是常识,不赘述。


2、保护碱基数目的问题。在设计PCR引物时,引入酶切位点后,常常要加入保护碱基,这是大家所熟知的。但是保护碱基数量多少,可能被新手所忽视。这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。


一般情况下,普通的内切酶只加入两个保护碱基,其内切反应就可以正常进行;而有一类,仅仅只加入两个保护碱基,其内切反应就不能正常进行,这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。如NdeI就属这类,需要加入至少6个保护碱基,常用的HindIII也要三个。


下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数,相信下列将有助于大这家的实验设计。


案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点,未注意到保护碱基数目的问题,设计PCR引物时,引入NdeI酶切位点后,只加上两个保护碱基,一个月内没有进展,始终不能成功构建重组载体。后查文献得知症结所在,在NdeI序列后加上六个保护碱基后,迎刃而解。大家引以为戒啊。


现在普通酶我都引入三个保护碱基。现在碱基合成价格也不贵了,为保证酶切充分,连接顺利,不用节约那点钱,再说若一次不成功,重复实验花费时间与金钱更多,孰利孰弊,不言自明。呵呵。


二、载体酶切的问题


1、质粒的单酶切鉴定。这个问题似乎很简单,但我认为很有着重强调之必要。现在大家手头的质粒都是转来转去的,其中的各酶切位点状况如何,是否能被有效地切开,这些问题都是要核实的。因此,在实验开始之前必须对质粒载体进行单酶切鉴定。


现在我每次构建之前,对所选择的克隆位点都要作一一鉴定,例如选择NdeI和HindIII作为克隆位点,就先分别对质粒上这两个酶的酶切位点进行单酶切鉴定。单酶切鉴定能有效地切开后,再发出引物合成定单,进行引物合成;若不能,就按“一”中原则进行调换。


2、连接反应的对照。在实验中,这步骤属于质粒载体与外源DNA片段的连接反应。成功与否,很大程度上取决于与质粒和DNA片段的酶切效果。


一般情况下,都在通用缓冲液中进行双酶切,但这两种酶在通用缓冲液中酶切效率不一样,这可能导致部分的单缺口的质粒片段存在,这样,在连接反应中,即使在外源DNA片段存在下,这种单缺口的质粒片段能够进行更快速有效自我连接。


最终结果是大量假阳性的菌斑生长。对照连接反应中,在不加入外源片段情况下,实验结果如果有菌斑生长,说明双酶切不充分,质粒DNA必须重新进行双酶切。


实验案例分析2:本人曾用XhoI和HindIII酶切位点构建重组质粒,对质粒进行双酶切后,直接就做连接,未上述两步鉴定,每次结果满板的菌斑。但就是没有阳性。后来对质粒进行单酶要鉴定后,发现XhoI酶切位点损坏。又是一个月没有进展,浪费精力和药品。


血的教训啊。因为当时没有注意到:单切质粒是一条带,双切质粒也是一条带,电泳行为上是一样的,分辨不出。如果做上述任何一个鉴定就会知道问题出在那儿,呵呵。


实验案例分析3:本实验室一个号称实验严谨的大博士,用KpnI和HindIII构建重组质粒,一个月未果,只得阴性斑,不得阳性斑,后怀疑KpnI酶失效。迁怒KpnI,在我不知情下扔掉实验室所有KpnI酶。我得知后,问他做过上述两鉴定实验后,他支吾着说没有,后经鉴定HindIII位点失效。


最后他责备本人暗中保留一手,没有倾攮相授。呵呵,他不自责自己不思考,只是木着脑袋做实验,反倒咬一口解铃人,再说我在那以前也不知道他遇到什么难题。呵呵,你说冤不冤?这世道啊!也可看出,实验室人员之间相互交流相当重要。


两星期前写了前两问题后,终于能抽时间写第三个问题,在做好前述两个方面工作后,这个问题相对简单。


三、连接时两片段浓度比问题


一般实验指导手册上都说质粒:片段=1:3(摩尔比),在实际操作中我以为在1:5甚至1:10为宜。做好“一、二”,16℃ 10小时后,每次都能有效地连接上。当然还有大肠杆菌感受觉态问题,我们以前自己做,现在懒得做了,都用“天为时代公司”的产品,感觉还不错(特别声明我不是天为公司内线,呵呵)。


这里介绍一个估测处DNA浓度的方法:DNA可以用紫外法检测,也可以电泳对比marker估测,在要求不是很精确情况下,大家不妨试试下面方法:


1.取一平皿。


2.薄薄倒一层含有EB的琼脂糖胶,凝固 (4 ℃可以存一个星期)。


3.平皿背面可以画成小方格。


4.一小格中点1 ul样品。


5.另一小格格点1 ul DNA标准品(我一般用Takara 2000 DNA lander,1 ul相当60 ng)


6.凉干后,紫外灯下根据亮度就可以估测了。


OK,我连接时这么估测浓度,5分钟就要可以知道两片段浓度。其实连接片段浓度比可以充许在一个范围内,1:5至1:10都可以,所以上述估测方法在这种情况下是行得通的。


(责任编辑:大汉昆仑王)

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