关键词: RT-PCR 实验步骤
来源: 互联网
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一、组织抽提:
1. 取组织块50-100㎎用液氮在研钵中研磨成粉末
2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol 抽打匀浆
3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打
4. 冰上孵育5分钟
5. 离心12,000g 4℃ 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管
6. 加0.2 ml氯仿,震荡,冰上孵育5分钟
7. 离心<12,000g 4℃ 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管
8. 加0.5 ml异丙醇,震荡,冰上孵育5分钟
9. 离心<12,000g 4℃ 5分钟 弃去上清液
10. 加入1 ml 75%乙醇,震荡
11. 离心<7,500g 4℃ 5分钟 弃去上清液
12. 室温下使之变透明
13. 加入DEPC处理水10μl --35μl 溶解RNA( 可保存在液氮或低温冰箱)
14. 走RNA变性电泳观察18s,28s条带,分光光度计检测260/280吸光度比值,计算RNA浓度
二、RT反应体系(第一步):约20分钟
RNA 抽提物
5μl
Radome 引物
2μl
RNA sin
0.5μl
1. 65℃ 15分钟
2. 立即放入冰浴
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