关键词: 氨基酸 组分 分析
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问:我有一蛋白想做氨基酸组分分析,想用6MHCl处理成单氨基酸后用高效液像色谱议做,请问具体如何做,谢谢?
答:这个问题比较大,呵呵,以前做过一点,和楼主讨论一下吧。
首先,氨基酸组成分析工作量不小,而且要求操作者有较高的操作水平,如果你只是为了检测一下的话,不如花点钱寄出去测测,自己做有时徒劳无功啊。液相色谱是可以做,但是检测机构都有专门的氨基酸分析仪(虽然核心也是一个HPLC)。
如果楼主坚持自己做,那么我说说以前我所了解的一些东西,也就是一个大概,因为也过去两年多了。希望能帮到你。氨基酸组成分析的实验过程(色谱法)主要分为:水解、衍生和色谱三步。
先说说水解,主要就是酸法和酶法,酸法会对某些氨基酸有破坏作用,而酶法虽然温和,但有时水解不完全。还是采用酸法的多一些。酸法时可以加入2%的苯酚作为保护剂,防止Met和Cys被氧化;对于Ser可以加入秋季乙醇保护,具体浓度记不清了。
对了,Cys最好要保护起来,否则定量不准,保护的方法可以烷基化,具体的过程可以查查文献。整个过程最好能抽真空并充氮。
衍生化的方法有很多,用得多的有OPA(用荧光检测器)和PTC(用254nm紫外检测)两种,都是柱前衍生,就是在上HPLC前进行衍生化。这个楼主可以查查文献,俺记不太清具体的操作了。基本上那些检测机构也就是这两种衍生用得多。
色谱就简单了,一般就是A相醋酸钠,B相甲醇或乙腈。两种方法出峰顺序不同,查到一篇使用某种方法的相关的文献就可以知道顺序了。然后积分分析就行。不过氨基酸组成分析的误差还是不小的,5~10%,甚至更大。
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