A. 裂解液 (lysis solution)
(8M Urea, 4%CHAPS, 2% Pharmalyte3-10, 40 ml)
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Final concentration |
Amount |
Urea(Fw 60.06) |
8M |
19.2g |
CHAPS |
4%(w/v) |
1.6g |
Pharmalyte3-10 |
2% |
800μl |
Double distilled H2O |
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To 40ml |
新鲜配制或者分装贮存于-20℃
① 如果需要,尿素的浓度可以调高到 9或者 9.8M,也可用 7M Urea,2M Thoiurea。
② 其他的去垢剂(如 Triton X-100,NP-40,还有其它的非离子去垢剂或者双性离子去垢剂)可以取代 CHAPS。
③ 如果需要,蛋白质酶的抑制剂和或者还原剂可以加入。
B.水化液
(不含有 IPG buffer, Rehydration stock solution without IPG buffer)
(8M Urea, 2% CHAPS, bromophenol blue,25ml)
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Final concentration |
Amount |
Urea (FW 60.06) |
12g |
12g |
CHAPS |
2%(w/v) |
0.5g |
Bromophenol blue |
0.002%(w/v) |
50μl |
Double distilled H2O |
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To 25ml |
分装贮存于-20℃
① DTT和 IPG buffer在用之前加入:每 2.5ml 水化液加 7mg DTT。如果胶内上样,则样品液在用之前加入到 2.5ml的水化液中。
② 如果需要,尿素的浓度可以调高到 9或者 9.8M。
③ 其他的去垢剂(如 Triton X-100,NP-40,还有其它的非离子去垢剂23或者双性离子去垢剂)可以取代 CHAPS。
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Final concentration |
Amount |
溴酚蓝储液
Bromophenol blue |
1% |
100mg |
Tris-base |
50mM |
60mg |
Double distilled H2O |
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To 10ml |
C. 水化液
(含有 IPG buffer,Rehydration stock solution with IPG buffer)
(8M Urea,2% CHAPS,0.5% or 2% IPG buffer,bromophenol blue,25ml)
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Final concentration |
Amount |
Urea (FW 60.06) |
8M |
12g |
CHAPS |
2%(w/v) |
0.5g |
IPG buffer(same pH range as the IPG strip) |
0.5%or 2%(v/v) |
125 or 500μltd> |
Bromophenol blue |
0.002%(w/v) |
50μl 1% solution |
Double distilled H2O |
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To 25ml |
分装贮存于-20℃
① DTT和 IPG buffer在用之前加入:每 2.5ml 水化液加 7mg DTT。如果胶内上样,则样品液在用之前加入到 2.5ml的水化液中。
②IPG buffer 的浓度取决于所用的等电聚焦系统和 IPG胶条的 pH 范围。
③ 如果需要,尿素的浓度可以调高到 9或者 9.8M。
④ 其他的去垢剂(如 Triton X-100,NP-40,还有其它的非离子去垢剂或者双性离子去垢剂)可以取代 CHAPS。
⑤ 浓度为 0.5%的 IPG buffer用 125μl IPG buffer,浓度为 2%则用 500μl。
D.平衡液(SDS equlibration buffer)
(50mM Tris-cl pH8.8, 6M Urea, 30% glycerol, 2% SDS, bromophenol blue, 200ml)
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Final concentration |
Amount |
1.5M Tris-cl,pH8.8(see solution F) |
50mM |
50mM 6.7ml |
Urea(Fw 60.06) |
6M |
72.07g |
Glycerol(87% v/v) |
30%(v/v) |
69ml |
SDS(Fw 288.38) |
2%(w/v) |
4.0g |
Bromophenol blue |
0.002%(w/v) |
400μl 1% solution |
Double distilled H2O |
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To 200ml |
分装 40ml 贮存于-20℃。这是一个贮存液。用之前在加 DTT或者碘乙酰胺。
E.单体贮存液(Monomer stock solution)
(30% acrylamide,0.8% N,N!-methylenebisacrylamide,200ml)
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Final concentration |
Amount |
Acrylamide(Fw 71.08) |
30% |
60.0g |
N,N`-methylenebisacrylamide(Fw 154.17) |
0.8% |
1.6g |
Double distilled H2O |
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To 200ml |
用 0.45微米的滤纸过滤。4℃避光保存。
F.4x分离胶溶液(4x Resolving gel buffer)
(1.5M Tris-Cl pH8.8, 1000 ml)
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Final concentration |
Amount |
Tris-base(Fw 121.1) |
1.5M |
181.5g |
Double distilled H2O |
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750ml |
HCl(Fw 36.46) |
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Adjust to pH8.8 |
Double distilled H2O |
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To 1000ml |
用 0.45微米的滤纸过滤,4℃保存。
G.10% SDS溶液
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Final concentration |
Amount |
SDS(Fw 288.38) |
10%(v/v) |
5.0g |
Double distilled H2O |
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To 50 ml |
用 0.45微米的滤纸过滤,室温保存。
H.10%过硫酸铵(10% Ammonium persulphate)
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Final concentration |
Amount |
Ammonium persulphate(Fw 228.20) |
10% |
0.1g |
Double distilled H2O |
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To 1ml |
当加入水时,新鲜的过硫酸铵会发出“咔嚓”声音。如果没有声音,则需要换新的药品。用之前配制。