蛋白来源:骨肉瘤CELL LINE
蛋白名称(可保密):Beta actin
蛋白分子量:42 kDa
WB用膜类型、孔径:Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)
转膜方式(恒压、恒流):湿转,恒压22 v
转膜时间:90 min
转膜设备:X-cell Sure Lock Mini-cell (Invitrogen)
建议改进方向:转膜过程冰水浴,保持低温,Transfer Buffer重复使用。
蛋白来源:肾瘤细胞
蛋白分子量:39 kDa
WB用膜类型、孔径:Nitrocellulose Membrane 0.2 um Pore Size (Invitrogen)
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压100 v
转膜时间:50 min
蛋白来源:MCF7
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:70 kDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜(GE)
转膜方式(恒压、恒流):湿转 100伏
转膜时间:60 min
转膜设备:伯乐小转膜仪
蛋白来源:pichia 分泌表达
蛋白名称(可保密):细胞因子等
蛋白分子量:17到30 kDa
WB用膜类型、孔径:millipore PVDF 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压:100 V
转膜时间:60 min
这个条件除了100 KDa的预染maker转的不好,剩下的条带都非常清晰。正向前面ycwzq说的,感觉时间不是很重要,只要蛋白别太小或太大,在一个比较宽的时间和电压范围都能转上。当然这些还有一个重要的影响因素就是所用的蛋白转印缓冲液。
所以建议把自己用的转印缓冲液的配方也贴上,便于分析交流。
我先说我的吧,是大师兄师姐的配方,我用了感觉还不错,但是100 KDa以上的转的不好。
蛋白转印缓冲液pH8.2:Tris碱1.93 g,甘氨酸9 g,甲醇200 ml,加水定容至1000 ml。
蛋白来源: 大鼠坐骨神经
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量: 30 kDa
WB用膜类型、孔径: PVDF膜(0.2 um)
转膜方式(恒压、恒流): 湿转 恒流300 mA
转膜时间: 45 min
转膜设备: Bio-Rad
蛋白来源:小鼠胚胎成纤维
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:36 KDa、55 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45
转膜方式(恒压、恒流):0.3 A 恒流
转膜时间:60 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad mini
垫子变薄时,可用三层纤维垫,也没问题。
蛋白来源:小鼠前列腺癌细胞
蛋白名称(可保密):P53 P21 RAD51 GAPDH
蛋白分子量:53 KDa、21 KDa、37 KDa、36 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45
转膜方式(恒压、恒流):恒压110 v
转膜时间:60 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad mini
蛋白来源:HEK293总蛋白
蛋白名称(可保密):***
蛋白分子量:~200KD
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.2 um (用甲醇预先处理)
转膜方式(恒压、恒流):恒压 25 V
转膜时间:过夜 (~16-20 hours)
转膜设备:biorad mini
蛋白来源:人前列腺癌细胞
蛋白名称(可保密):***
蛋白分子量:~40 KD
WB 用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 um (用甲醇预先处理)
转膜方式(恒压、恒流):恒压 20 V, 限制最高电流0.3 A。
转膜时间:过夜 (~16-20hours)
转膜设备:biorad semi-dry
蛋白来源:组织
蛋白名称(可保密)
蛋白分子量:42 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜(0.22)
转膜方式(恒压、恒流):350 mA 恒流
转膜时间:60-90 min
转膜设备:湿转 Bio-Rad
蛋白来源:E.Coli BL21
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:4 kd
WB用膜类型、孔径:PVDF 0.22 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压15 v
转膜时间:O/N
转膜设备: Bio-Rad Mini 湿转
转膜液的配制:for 1 L transfer buffer, 200 ml Methanol,14.4 g Glycine,3.03 g Trizma-base。
用了Trcine-gel SDS Page,效果不错
蛋白来源:肾脏
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:23 kd
WB用膜类型、孔径:PVDF 0.45 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压20 v
转膜时间:35 mins
转膜设备: Bio-Rad 半干
蛋白来源: 来自MDCK增殖的流感病毒裂解物
蛋白名称(可保密):PB1
蛋白分子量: 96 kd (注意,10% SDS-PAGE,冰上电泳。用预染marker观察100kd的条带跑到胶的正中间位置时,才开始转膜,否则转膜效率降低)
WB用膜类型、孔径: NC膜, 0.45
转膜方式(恒压、恒流):恒压,100V
转膜时间: 2 hours
转膜设备: BIO-rad 转膜设备。其间,准备一个冰盒,将电泳槽半埋到冰里。
转膜液的配制:(如甲醇的比例和是否加SDS以及多大质量浓度等): 2.9 g甘氨酸,5.8 g tris,0.37 g SDS,200 ml甲醇。
蛋白来源:肾脏
蛋白名称(可保密):
蛋白分子量:9 kd
WB用膜类型、孔径:PVDF 0.22 um
转膜方式(恒压、恒流):恒压20 v
转膜时间:30 min
转膜设备: Bio-Rad 半干
蛋白来源: 软骨细胞
蛋白名称(可保密):b-actin
蛋白分子量: 43 kd
WB用膜类型、孔径: PVDF膜, 0.45
转膜方式(恒压、恒流):湿转,恒流,350 mA
转膜时间: 85 min
转膜设备: BIO-rad 转膜设备。其间,准备一个冰盒,将电泳槽半埋到冰里。
转膜液的配制:(2.92 g甘氨酸,5.8 g tris,0.375 g SDS,200 ml甲醇,用双蒸水定容到1 L)
蛋白来源:宫颈癌细胞
蛋白名称:保密
蛋白分子量:60 kD
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45 uM
转膜方式(恒压、恒流):恒流,按膜的面积来算电流,标准大小的膜-60 mA/张
(8.2 cm x 6.0 cm)
转膜时间:2 h
转膜设备:Biorad semi-dry
转膜液的配制:Boston Bioproduct Transfer buffer+10-20% 甲醇
建议改进方向:
做半干转的时候,三明治上面再压一张滤纸,可以保证压紧,转膜效率稳定。用这个条件做过不少不同分子量的蛋白,最小从15 kD,到最大235 kD,都可以得到稳定结果。转膜液只用一次,不重复使用。
蛋白来源:家牛肝细胞
蛋白名称(可保密):保密
蛋白分子量:30 kDa
WB用膜类型、孔径:NC, 6x8 cm, 0.45 um
转膜设备:Invitrogen 湿转,外层冰水浴冷却。
转膜方式(恒压、恒流):恒流170 mA
转膜时间:根据胶的厚度而定,每0.5 mm转30 min, 1.5 mm的超厚预制胶转1.5-2 h。
转膜液的配制:10 mM碳酸氢钠,3 mM碳酸钠,20%甲醇。
建议改进方向:已考染的胶脱色后可以用此法转膜,条带稍淡但不影响结果。
蛋白来源:组织
蛋白名称(可保密)
蛋白分子量:170 KDa
WB用膜类型、孔径:PVDF膜(0.45)
转膜方式(恒压、恒流):300 mA 恒流
转膜时间:170 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
蛋白来源:HepG2细胞
蛋白名称(可保密):Akt及P-Akt
蛋白分子量:55KDa/56KD
WB用膜类型、孔径:PVDF膜 0.45孔径
转膜方式(恒压、恒流):100V 恒压
转膜时间:75 min
转膜设备: 湿转 Bio-Rad
蛋白来源:大鼠
蛋白名称(可保密):Bactin(42 KDa)
WB用膜类型、孔径:PVDF(0.45)膜
转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流150 mA
转膜时间:100 min
转膜设备: 北京六一
蛋白来源: 大鼠大脑皮质
蛋白名称(可保密):b-actin
蛋白分子量: 43 kd
WB用膜类型、孔径: PVDF膜, 0.45
转膜方式(恒压、恒流):半干转,恒流,2 mA/cm2
转膜时间: 8-55 min
转膜设备: BIO-rad 转膜设备。
转膜液的配制:(2.92 g甘氨酸,5.8 g tris,0.375 gSDS,200 ml甲醇,用双蒸水定容到1 L)
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