WB 条带大小和蛋白预测八字不合?先检查这 5 点!
实验室玄学千千万,预测和结果不符占一半。WB 实验是各位艾粉们,时常光顾的一个实验。但就是这样一个初级又常用的实验,却会出现各种稀奇古怪的问题。比如在 WB 实验鉴定蛋白时,我们得到的蛋白质条带大小常常会和预测值有所偏差。这是身患「强迫症」的艾粉们不能忍的。如果是实验出错或者预测不准这种情况,小艾是没办法跳出手机屏幕救你了。但这下面的 5 条准则,艾粉们倒是可以珍藏一下,在遇到蛋白质条带大小和预测值偏差的时候,拿出来分析一下。我们可 ...
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血清总蛋白的测定(双缩脲法)
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操作篇:western blot 之封闭及杂交
封闭及杂交在做杂交时,个人建议:还是使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育,这样节约抗体。操作开始:1. 将膜用 TTBS 从下向上浸湿后,移至含有封闭液的平皿中,室温下脱色摇床上摇动封闭 1 h。必要时可先用丽春红染色(2%乙酸,0.5%丽春红的水溶液)观察蛋白条带,再用去离子水和 TTBS 将丽春红洗脱后封闭,如用蛋白 marker 则可省略此步。2. 将一抗用 PBST 稀释至适当浓度(在 1.5 ml 离心管中);撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保 ...
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磷酸化蛋白 WB 做不好?文献指出了你可能忽略的重要原因
WB 是检测和定量磷酸化蛋白质的重要实验方法,然而大家一直都说磷酸化蛋白 WB 不好做!这是因为处于不同的细胞生长状况和 / 或特定的细胞周期时,磷酸化蛋白可能仅占细胞总蛋白中的一小部分,处理不得当时,还会快速的去磷酸化。磷酸化蛋白质 WB 做不好的原因有许多,比如封闭问题,抗体问题,或所需的磷酸化蛋白可能不存在于样品中或者低于 WB 检测的量。然而,有一个常被大家忽视的重要原因就是蛋白样品制备所用的方法是否适合于磷酸化蛋白的提取?其实蛋白质提 ...
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