2) Rho1D4的历史
Rho1D4的表位和抗体配对最早于20世纪80年代被发现,当时科学家将Rho1D4抗体交联包被在琼脂糖凝胶上,用来纯化通过猴肾细胞表达的牛视紫红质。
1,2从那时起,Rho1D4系统开始被广泛的用于小量膜蛋白提取的研究中,包括GPCR(G蛋白偶联受体),ATP结合盒转运蛋白(ATP-binding cassette transporter),溶质反向转运体和以及一种含四个跨膜域的膜蛋白。
3) Rho1D4系统的优势和用途
高纯度
Rho1D4系统包含:标签、抗体偶联亲和基质(琼脂糖或磁珠等)以及洗脱多肽。Rho1D4系统的最大优势在于抗体与抗原相互作用的高度特异性。表位序列和链长对结合至关重要。
例如,将第三位丙氨酸替换成甘氨酸,即移去一个甲基基团,抗体将不再与表位结合。同样,完整的九个氨基酸标签会与Rho1D4抗体结合紧密,去除两个氨基酸则阻断结合。因此,含有与Rho1D4表位相似序列的蛋白引起的非特异性结合被最小化,因此回收蛋白的纯度非常高。(见表1) 3,4,5,6,7,8
高回收量
而Rho1D4系统的另一个优势是洗脱目标蛋白的高回收率。包括细菌,酵母和哺乳动物细胞系在内的表达系统已经针对特定的GPCR和其他膜蛋白进行了优化。用Rho1D4系统纯化后的膜蛋白通过凝胶过滤以除去用于洗脱的多肽。使用此纯化系统的科研人员均反馈蛋白回收量均达到毫克级。(见表1)3,4,5,6,7,8
纯化的膜蛋白可用于功能性研究
纯化的蛋白可用于功能性研究,如配体结合的特性,蛋白与蛋白间的相互作用。例如,将标记过的ABCA4固定在载有Rho1D4抗体的基质上来确定它与天然配体(一种视网膜的加成物)的亲和结合特性,加入ATP后即释放2。
又例如,CD81蛋白被整体固定在涂有Rho1D4抗体的平板上,它表现出和分离可溶蛋白片段与丙型肝炎病毒包膜E2蛋白相同的亲和结合力3。另外,有阴离子转运载体AE1结构域的重组蛋白被标记且用Rho1D4系统纯化后表现出与红细胞来源的AE1蛋白有相同的硫酸外排速率。
4) 利用Rho1D4纯化膜蛋白图解简述
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步骤1:结合:将Rho1D4标记的蛋白与载有Rho1D4抗体的琼脂糖一同孵育使得目标蛋白被固定在吸附材料上。 |
步骤2:清洗:将杂蛋白和其他裂解液成分洗去,留下与亲和基质结合的目标蛋白。 |
步骤3:洗脱:过量Rho1D4肽与基质竞争性结合,释放出目标蛋白在洗脱液中收集。 |
表1:膜蛋白应用实例
蛋白 |
表达系统 |
纯度 |
产率 (所有回收蛋白) |
采取的纯化步骤 |
hCB2 G蛋白偶联受体 |
大肠杆菌 |
90% |
4.5mg/5L 培养物 |
Rho1D4 IAC+SEC |
hVN1R1 G蛋白偶联受体 |
可诱导的HEK293S细胞系(哺乳动物) |
90% |
1mg/1g细胞 |
Rho1D4 IAC+SEC |
FPR3 G蛋白偶联受体 |
可诱导的HEK293S细胞系(哺乳动物) |
90% |
2mg/6g细胞 |
Rho1D4 IAC+SEC |
TAAR5 G蛋白偶联受体 |
可诱导的HEK293S细胞系(哺乳动物) |
90% |
1mg/9g细胞 |
Rho1D4 IAC+SEC |
OR131-2 G蛋白偶联受体 |
可诱导的HEK293S细胞系(哺乳动物) |
90% |
2.9mg/10g细胞 |
Rho1D4 IAC, +centrifugation |
hOR17-4 G蛋白偶联受体 |
可诱导的HEK293S细胞系(哺乳动物) |
90% |
7.5mg/2.5L, 培养物 |
Rho1D4 IAC+SEC |
hOR17-4 G蛋白偶联受体 |
无细胞小麦胚芽提取物 |
70%* |
0.3mg/mL, 反应溶液* |
Rho1D4 IAC+SEC |
CD81 四次跨膜蛋白 |
可诱导的HEK293S细胞系(哺乳动物) |
>95% |
26μg/3×107, 个细胞 |
Rho1D4 IAC |
AE1 溶质载体 |
S.啤酒系BJ5457 |
93% |
2.5mg/18L. 培养物 |
Rho1D4 IAC |
*纯度是从低浓度经一步Rho1D4 IAC在反应溶液中得出的;产率是在洗脱成分浓缩并过SEC柱后计算的
表1:有文献报道的使用Rho1D4系统纯化膜蛋白的纯度和产率。尽管很多用Rho1D4系统纯化的膜蛋白均为G蛋白偶联受体家族,该系统也可以有助于辨别其他如转运体之类的膜蛋白。相关文章在参考文献中。IAC:免疫亲和层析;SEC:排阻层析。
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