(二)试剂与器材
1.试剂
(1)试剂甲:
(a)10克Na2CO3,2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6•4H2O)。溶解于500毫升蒸馏水中。
(b)0.5克硫酸铜(CuSO4•5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份(a)与1份(b)混合,即为试剂甲。
(2)试剂乙:在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4•2H2O),25克钼酸钠(Na2MOO4•2H2O)及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克硫酸锂(Li2SO4),50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1n左右。
(3)标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或g―球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9%NaCl溶液。
2.器材
(1)可见光分光光度计
(2)旋涡混合器
(3)秒表
(4)试管16支
(三)操作方法
1.标准曲线的测定:取16支大试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml)。用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温(20~25℃)放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙(folin―酚试剂),同样立即混匀。这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线。
注意:因lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即第1支试管加入5毫升试剂甲后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲,2分钟后加第3支试管,余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后加第3支试管,余此类推。待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。
进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的顺序,逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。
folin―酚试剂法实验表
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(250mg/ml)
未知蛋白质 0.2 0.4 0.6
(约250mg/ml)
蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4
试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
每管中蛋白质的量(mg)
吸光度值(a700)
2.样品的测定:取1毫升样品溶液(其中约含蛋白质20~250微克),按上述方法进行操作,取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起,同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面,再增加3个试管。如上表中的8、9、10试管。
根据所测样品的吸光度值,在标准曲线上查出相应的蛋白质量,从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸,显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度(相对于标准蛋白质)。