详细介绍引物设计原则
引物设计原则一:1. 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响 ...
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酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶
本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列,如AccI,AflIII,AscI,AvaI,BamHI,BglII,BssHII,BstEII,BstXI,ClaI,EcoRI,HaeIII,HindIII,KpnI,MluI,NcoI,NdeI,NheI,NotI,NsiI,PacI,PmeI,PstI,PvuI,SacI,SacII,SalI,ScaI,SmaI,SpeI,SphI, ...
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PCR 扩增常见问题及特点
常见问题PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性,不出现扩增条带。PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模 ...
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PCR反应条件如何选择?
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。 温度与时间的设置:基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90~95℃变性,再迅速冷却至40~60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70~75℃,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100~300bp时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一 ...
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