PCR一般步骤
(一)总RNA提取取液氮冻存脑组织置于玻璃匀浆器中,按100g:3ml的比例加入Trizol试剂,严格按照TrizolRNA提取试剂盒说明书的流程进行。(1)加Trizol(按3ml/100mg组织,宁多勿少)置于玻璃匀浆器中匀浆后,冰浴10-15min。(2)移入1.5mlEP管中,4ºC 13000g离心10min。(3)上清液移至另一EP管中,室温放置10-15min。(4)加入0.2ml氯 ...
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PCR基因扩增原理及方法步骤
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7年分子克隆经验总结
做了快7年的分子克隆,从加样加不好,到现在轻松PCR,我想分子生物学这块还是有很多经验可以分享一下的。或许很多人会说分子克隆过程中出现问题最多的大概就是连接了,大家抱怨的也最多,我也陷入在个步骤上很久。经过长时间的摸索我在连接这个问题上有一些体会,我认为连接的问题多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。但是我认为,连接不成功,问题并不一定出在连接这步上。有很多 ...
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为什么 PCR 跑不出满意的结果?
PCR 是一个坑,坑里埋了好多研究僧……PCR 是众位「研究僧」日常实验中最常用的技术,可谓是「研究盛宴」中的一道「小菜」。可也有不少童鞋反映,这道菜不好吃,一不小心就「小河里翻船」。那么,我们该如何把这道菜「吃好」、跳出这个「坑」呢?诸位看官莫急,待我送君「三大法宝」。一、确保 RNA 样本合格常见的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法,这两个方法各有所长,但都不能保证提取的 RNA 样本一定合格。因而,提取完成后应测定 RNA 的浓度及吸光度。通常,在 260,280, ...
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