关键词: PCR SOE法 SDL法
来源: 丁香园论坛
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PCR技术:PCR片段拼接的SOE和SDL方法PCR技术(多聚酶链式反应)是现代分子生物学的一个巨大突破,它能在体外迅速、 大量、灵敏地扩增基因片段。可是,经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效 拼接,却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点,这不但操 作繁杂,而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因 拼接的新方法,即SOE和SDL法,就能巧妙地解决这个问题。SOE法 1989年,Horton等人提出了SOE法(Gene splicing by over lap extension),即通过复制时DNA链的交错延伸不实现基因拼接。本法可分四步进行。 (1)引物设计:引物a和d是常规引物;b的左半段为常规引物,右半段为基因Ⅱ的引 物序列;c同理;则b和c的部分碱基可互补配对。 (2)基因I、Ⅱ分别扩增,产物相应为片段A、B和C、D。 (3)两种产物混合,经变性及退火处理,A链和D链部分碱基互补配对,成杂交链。 (4)在DNApolymeraseI作用下,A和D链互为引物和模板,合成出A'D'链,即为基因I 和基因Ⅱ的接接产物。若在引物中引入突变的碱基序列,则在接接产物中,将按预先 设计要求出现定点突变。SDL法 1991年下半年,Lebedenko等人提出SDL方法(Gene splicing by directed ligation),即直接拼接法,它在SOE法基础上又有新的突破。本法的要点如下: (1)限制性内切酶,EcoRI核酸内切酶(或其它Ⅱs类限制性内切酶)能专一性识别 6bp的非回文序列,并能单向特异性地切断EcoRI识别的6bp以外的1—5个核苷酸,产生一个以突出的4个核苷酸为结尾的5'末端。因而该伸头末端与酶切位点序列无关, 而是由切点附近的序列决定的。 (2)扩增时实际运用的引物的构建。以exon5的实用引物为例:5' 链引物包括常规5' 链引物序列和BamHI识别位点及起密码序列;3’ 链引物包括常规3' 链引物和AC及EcoRI 识别位点。 (3)唯一性末端的形成。经扩增和限制性内切酶处理后可得供拼接的exon5,它的右 侧突出末端TCAC中,TC为原始exon5的一部分,AC为原始exon6的一部分,且TCAC与 exon6的AGTG互补配对,其余类推。因为这种结尾相同的几率为1/259,故可被视作 “唯一性末端”。 (4)把经扩增的exon5、exon6和exon7混合,依据碱基互补配对原则,它们就能按顺序依次拼接。显而易见,在SOE法中,退火时的最希望产物是AD,杂交链,但A链和B链,C链和D链 配对的可能性更大,另外还有B、C链的配对,这些都是不利的;而SDL法中就不存在这个问题。另一方面,由于不需DNA polymerase I,避免了它在复制中可能带来的错误,所以,SDL法更优越。
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电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?不会没成功吧?
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双非博士真就如大家所说没有出路?
双非博士一枚,在老师的指导下,自己也算勤奋,发了三四篇SCI,其中有一篇顶刊,手头上还有一些工作没有处理完,本来心里有些自卑,面对现在外界所说双非博士的各种言论,导致自己有些不知所措。以后进高校,哪怕你有好文章也是会四处碰壁嘛?想问问过来人的经验。
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PCR有产物但是电泳无结果
PCR后用紫外分光测定DNA含量都在450-500ug/ul,但电泳无目的片段的条带,内参也没条带。电泳中maker能跑出条带,用引物也点了样,引物的条带稍模糊但还是有,请问是哪里出了问题?
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