2.7 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
2.7.1 测序凝胶板的制备
玻璃板的处理:银染测序的玻璃板一定要非常清洁。实验过程中,先用温水和去污剂洗涤,再用去离子水冲洗玻璃板,除去残留的去污剂,最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高。每次铺胶前均需分别严格处理长玻璃板和短玻璃板。
(1)长玻璃板的处理
a) 用浸透亲和硅烷溶液(1ml左右)的镜头纸擦拭清洗过的长玻璃板。长玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上;
b) 五分钟后用吸水棉纸沾95%乙醇洗长玻璃板3次,以除去多余Sigmacote溶液。
(2)短玻璃板的处理
a) 更换手套,避免与亲和硅交叉污染;
b) 用浸透剥离硅烷溶液(1.5ml)的镜头纸擦拭清洗过并已经自然干燥的整个玻璃板板面;
c) 五分钟后,用干净纸头单向擦玻璃板,然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次,每次均须换用干净的纸,以除去多余的粘合溶液;
d) 实验中根据温度等实际情况调整剥离硅烷的涂量。这一步对于在银染操作过程中防止凝胶撕裂至关重要。
(3)测序板处理的注意事项
a) 在单向擦玻璃板时不要过度用力,否则会带走过多粘合硅烷,使凝胶不能很好地粘附;
b) 一定要更换手套,防止粘染粘合硅烷,否则将导致凝胶撕裂;
c) 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡30~60min后除去;
d) 为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松驰。
2.7.2 凝胶的制备:
(1) 固定玻璃板
用0.4mm厚的边条置于长玻璃板左右两侧,将短玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘,用夹子固定住。
(2)制备测序凝胶(6%)
先用适量双蒸水溶解尿素,再加入Acr&Bis和10×TBE缓冲液,再用双蒸水调终体积至99.2ml,并用0.45mm的滤膜过滤,然后再加过硫酸铵和TEMED。
表2-1 聚丙烯酰胺凝胶浓度表
Table 2-1 table of the polyacrylamide gel strength
(3)灌制胶板
将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中,倒完后,静止放置使之聚合完全。一般在胶灌制后4-6分钟,即开始聚合,如果聚合不好,则应使用高浓度的TEMED和过硫酸铵。
(4)凝胶制备过程中的注意事项
a) 使用夹子固定玻璃板时,最好夹子的力量稍大一些,防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。
b) 溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后,方可加入TEMED和过硫酸铵。
c) 灌制凝胶的过程中要严防产生气泡,否则影响测序的结果。
2.7.3 预电泳
(1)当凝胶聚合完全后,拨出鲨鱼齿梳,将该梳子反过来,把有齿的一头插入凝胶中,形成加样孔。
(2)立即将胶板固定在测序凝胶槽中,一般测序凝胶槽的上下槽是分开的,因而只有在固定好凝胶板后,方能加入TBE缓冲液。
(3)稀释10×TBE缓冲液至1×TBE,将该缓冲液加入上下二个电泳槽中,去除产生的气泡,接上电源准备预电泳。
(4)先将水浴加热至55℃后进行预电泳。
(5)按30V/cm的电压预电泳20-30分钟(恒功率80-90W,约30min)。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子,同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构,影响测序的结果。
(6)预电泳的注意事项
a) 用鲨鱼齿梳制作加样孔时,应注意将齿尖插入胶中0.5mm左右,千万注意不能使加样孔渗漏,否则得不到正确的结果;
b) 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏,否则极易造成短路而损坏电泳仪;
c) 厚度小于0.4mm的胶可能导致信号太弱。