在实验中发现SSCP对短链DNA或RNA的点突变检出率要比长链的高,这可能是由于长链DNA和RNA分子中单个碱基的改变在维持立体构象中起的作用较小的缘故。而有人认为在DNA链较短的(400 bp 以下)情况下,DNA的长度不会影响SSCP的效果。他们仔细选择了实验条件,发现354 bp 的DNA中点突变的检出率仍可达到90%以上。
由于在SSCP分析中非变性PAG电泳不是根据单链DNA分子和带电量的大小来分离的,而是以单链DNA片段空间构象的立体位阻大小来实现分离的,因此,这种分离不能反映出分子量的大小。有时正常链与突变链的迁移率很接近,很难看出两者之间的差别。因此一般要求电泳长度在16~18 cm 以上,以检测限为指标来判定结果。
检测限是指突变DNA片段与正常DNA片段可分辨的电泳距离差的最小值。大于检测限则判定链的迁移率有改变,说明该DNA序列有变化,小于检测限则说明链之间无变化。例如,一般检测限定为3 mm,那么当两带间距离在3 mm 以上,则说明两链之间有改变。另外检测限不能定的太低,否则主观因素太大,易造成假阳性结果。另外,SSCP分析中其它条件,如PCR产物的上样量,PAG的交联度、以及胶的浓度等,都应根据具体实验进行选择确定。