关键词: PCR 引物
来源: 爱上科研有点难
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茫茫的实验过程中,你是否遇到过如下的困境:
做完 PCR,跑胶发现有多条很诡异的条带……
更为可怕的是,做完二代测序发现了一个崭新的突变点,一代测序验证也能开心的验证出来,但发文章时,别人告诉我们,这其实是相似序列引发的假阳性……也就是说,相似序列之间的差异碱基,刚好就是那个所谓的突变点!一代测序也枉然!
以上的问题,可能多半都是因为引物不特异。
也就是说,同一对引物,能匹配基因组上好几个位置。
所以,设计完引物,做一个在线的 PCR,以保证引物的特异性,是特别好的习惯~
下面分享两个可以完成此任务的在线工具!
1. Primer-BLAST
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi
以 ERBB2 基因的某个外显子为例,序列如下:
随意拉出一对引物
F: CAGCCCCCTTCGCCCCGAGAGGGCCCTCTGCCT
R: ACCCTAGAGTCTCATTGGGCAGGGCC
用以扩增出此段的 DNA 序列,打开 PRIMER-BLAST,Template 空置,引物填入对应的位置
PCR 产物最大值可以根据,实验具体情况进行调整,选择物种,此处是以人基因组 DNA 模版为例(如果做 RNA 层面研究,可以选取 mRNA)
点击 Get Primer,得到结果
可以看到产物是唯一的,再试另外一对引物(MUC4 基因)
可见此对引物,可以扩增出基因组上两段产物。而且是引物完全匹配,在不知情的情况下,可能会得到非常有迷惑性的实验结果,这预计也是 MUC4 在很多数据库中都有高突变频率的原因,存在大量的因重复序列造成的假阳性。
2. In-Silico PCR
http://genome.ucsc.edu
简单易用,直接把上下游引物输入即可。依次再测试一下上面的两对引物。
第一对:
可以看到结果是唯一的!
第二对:
出现了两个扩增产物,此结果中,两个产物的长度差异较大,相对比较容易甄别。对于一些长度差异较小的,可能会对实验结果造成极大的干扰,而且可能打击实验的积极性~
今天就到这里啦,希望各位小伙伴实验顺顺利利!
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电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?不会没成功吧?
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双非博士真就如大家所说没有出路?
双非博士一枚,在老师的指导下,自己也算勤奋,发了三四篇SCI,其中有一篇顶刊,手头上还有一些工作没有处理完,本来心里有些自卑,面对现在外界所说双非博士的各种言论,导致自己有些不知所措。以后进高校,哪怕你有好文章也是会四处碰壁嘛?想问问过来人的经验。
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PCR有产物但是电泳无结果
PCR后用紫外分光测定DNA含量都在450-500ug/ul,但电泳无目的片段的条带,内参也没条带。电泳中maker能跑出条带,用引物也点了样,引物的条带稍模糊但还是有,请问是哪里出了问题?
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