荧光定量 FAQ 专题:前期准备

荧光定量 FAQ 专题:前期准备

关键词: 荧光定量 qPCR

来源: 诺唯赞

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充分的准备是实验成功的关键,那么,qPCR 实验需要提前做好哪些了解呢?

试剂的储存条件


市面上大多数 qPCR 试剂推荐 - 20 ℃ 避光长期储存。

Vazyme 的 ChamQTM 和 AceQ? 两个系列的 qPCR Master Mix,长期储存应置于 - 20 ℃ 避光,解冻后可于 4 ℃ 短暂存放;避免反复冻融。

原始模板稀释倍数

—是不是拿到一个 cDNA 模板就直接做 qPCR?

—NO!

—是不是拿到一个 cDNA 模板就直接做 qPCR?

—NO!

—是不是对怎么确定稀释倍数倍感无助?

……

尽量选择 Ct 值落在 15-28 范围的稀释倍数作为原始模板稀释度。

反应体系与次数

推荐 20 μl 体系,Vazyme ChamQTM/AceQ? QPCR Master Mix 5 ml 可供 20 μl 体系 500 次反应。

伙伴们问:那用 10 μl、25μl、50 μl 体系可以吗?

小 V 回答:可以,可以,必须可以!

Vazyme ChamQTM/AceQ? QPCR Master Mix 系 2×预混 Mix,推荐体系 20 μl,只要是等比例放大或缩小体系,实验就能得到保证哦~

模板的上样量

若直接使用 cDNA 原液作为模板,建议使用体积不超过 qPCR 反应总体积的 1/10!

当复孔之间重复性不佳时,可将模板做适当稀释后以大体积加入反应体系,可有效提高实验重复性。看小 V 做的实验,是不是重复性爆表啊~~~

预变性时间

常见的 qPCR 试剂预变性时间从 30 sec - 15 min 不等。科学家们为了封闭常温下酶的活性,使 qPCR 产生非特异性扩增的概率降到最低,想出了这种只有在高温下经过一定的时间才能激活并释放活性的酶—热启动酶。

热启动酶多用两种修饰方式:化学修饰和抗体修饰。

例如:

Vazyme 的 ChamQTM QPCR Master Mix 中的 Champagne TaqTM DNA Polymerase 是经过抗体修饰的 Taq DNA Polymerase,95 ℃ 加热 30 sec 就可以灭活抗体激发酶活。AceQ? QPCR Master Mix 中 AceTaq?DNA Polymerase 是经过化学修饰的 Taq DNA Polymerase,在温度低于 80 ℃ 时活性被完全封闭,只有 95 ℃ 加热至少 5 min 酶的活性才被释放。有效防止了在样品准备及反应升温阶段产生非特异扩增和引物二聚体。

ROX 的选取

ROX:一种不受 PCR 反应影响的参比染料,可校正单次反应运行中的信号误差、移液误差或蒸发所导致的体积差异,提供更连续一致的重复 Ct 值。

伙伴们好不容易申请到了一份试用装,然而打开后却发现有两管 ROX,到底该怎么选择呢?

小 V 告诉你:一卡在手,ROX 使用从此不用愁!

赶快拿去对照一下自己的仪器,看看应该用哪一个哦~不同仪器 ROX 的选取参照卡,拿去~

(小 V 再偷偷告诉你:这张卡其实是个冰箱贴哦~)

有了这些干活,伙伴们的准备工作就妥妥的了。

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