关键词: RT-PCR 详细步骤
来源: 丁香园论坛
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1.材料和方法Access RT-PCR System 试剂盒 (A1250):Promega 公司产品。500u AMV Rev 目的基因 se Transcriptase, 5u/ul500u Tfl DNA Polym 目的基因 ase, 5u/ul1 ml AMV/Tfl 5×Reaction Buff 目的基因1.25 ml MgSO4, 25 mM100ul dNTP Mixture, 10 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP50ul Positive Control RNA with Carri 目的基因 (1.25 attomole/ul)100ul Upstream Control Prim 目的基因, 15ulM100ul Downstream Control Prim 目的基因, 15uM13 ml Nuclease-Free Wat 目的基因1.2 方法总 RNA 提取具体步骤:1) 称取各组的大鼠肺组织标本 50-100 mg,用剪刀将组织块剪成若干碎块 (须避免 RNA 酶的污染)。2) 将组织碎块加入 1 mlTripure 中 (所加组织块的体积不能超过 Tripure 体积的 10%),在玻璃匀浆器中充分研磨至无明显大的组织块为止,研磨过程在 0℃ 冰水中进行,以防止组织 RNA 被降解。3) 然后将组织匀浆液转移到 1.5 ml 的 Eppendorf 管中,15℃-25℃ 的环境中孵育匀浆 5 min,使核蛋白复合体完全分离。4) 加入 0.2 ml 的氯仿,盖紧盖子,放在震荡器中剧烈震荡 15 秒左右,15℃-25℃ 的环境中孵育 2 min-15 min。5) 2℃-8℃ 冰冻离心机中离心 (12000 g/min,15 min)。此时可见液体分层:底层——红色酚氯仿相;中间层——界面相;上层——无色液相。6) RNA 仅存于上清中。将上清转移至新管中 (切勿将中间层误吸入),7) 加入 0.5 ml 的异丙醇,充分混匀,室温 5 min-15 min。8) 2℃-8℃ 冰冻离心机中离心 (12000 g/min,10 min)。9) 弃上清 (动作轻,慢),在管底部可见一乳白色小沉淀物,即为 RNA。10) 加入 1 ml75% 乙醇,混合震荡,(可在 2℃-8℃ 中保存一周,-15-25℃ 中保存一年)11) 2℃-8℃ 冰冻离心机中离心 (7500 g/min)5 min 弃上清,12) 通风,室温中干燥 5 min-10 min,让乙醇挥发(根据肉眼观察管内水分情况,不能太干,RNA 干后难溶解)。13) 加入 30ul-50ul 的 0.1% 的 DEPC,吹打数次,14) 55-60℃ 孵育 10 min,冰上冷却,15) 供下一步实验使用或-70℃ 冻存。RNA 完整性的检测1) 制备琼脂糖凝胶,称取琼脂糖凝胶 0.34 g,加入 0.5×TBE 缓冲液 20 ml,微波炉加热至熔化。2) 最后配成终浓度为 1.7% 琼脂糖凝胶液体。3) 加入溴乙啶 (0.5 mg/ml)2ul,混匀。4) 冷却至室温。5) 在水平电泳槽上制胶,凝固后浸入 0.5×TBE 缓冲液中,除去样本梳。6) 取 1ugRNA 与 1.5ul 甲醛、4.5ul 甲酰胺混合, 60℃ 水浴 10 min,加入 1ul 上样缓冲液 (0.25% 溴酚蓝;40% 蔗糖),75mv 电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的 2/3 处。RNA 的纯度和浓度检测1) 预热 GeneQuant 并调制好各项参数,2) 用灭活的 DEPC 水 1000ul 调零。3) 取 RNA 样品 1ul,加入灭活的 DEPC 水 1000 ul,混匀。4) 直接读取 RNA 浓度和 Ratio,并根据稀释情况得出实际的 RNA 浓度,重复操作三次取平均值。5) RNA 的 Ratio 均在 1.7-2.0 之间。RNA 浓度在 0.5ug/ul-1ug/ul,分装 10ul 一管,于-70℃ 冰箱中冻存。RT-PCR(一)引物的配制:1. 将所合成的目的基因和 GAPDH 上下游引物 (1OD) 用 0.1% DEPC 水溶解。2. 根据各个引物分子量的不同,计算加 0.1%DEPC 水的量。3. 目的基因和 GAPDH 上下游引物所加的 0.1% DEPC 水量分别为:488ul,431ul,ul,ul 使其终浓度均为 20pmol/ul。4. 于-20℃ 冰箱中冻存,备用。RT-PCR 反应体系 (25ul):无酶水 14.4ulAMV Buff 目的基因 5uldNTP 0.5ul目的基因上游引物 0.75ul目的基因下游引物 0.75ulGAPDH 上游引物 0.75ulGAPDH 下游引物 0.75ulMgSO4 0.8ulTfl DNA Poly 0.5ulRNA 0.8ul将上述各成分混匀并覆盖石蜡油 20 ul,标注号码后放入基因扩增仪内。RT-PCR 扩增的条件与参数:48℃,45 min,94℃,2 min; 94℃ 30s,58℃ 60s,68℃ 2 min 共 40 个循环;循环完毕后 68℃ 延伸 7 min。扩增产物进行电泳或-20uC 冻存。RT-PCR 产物分析:(一)RT-PCR 产物电泳分析1. 取 6 ul RT-PCR 产物与 1ul 上样缓冲液混合后上样于 2% 琼脂糖凝胶,同时以 0.8ul Ladd 目的基因点样,以 0.5×TBE 为缓冲液电泳。2. 75mv 电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的 2/3 后,紫外灯下观察,扫描、拍照并进行图像分析。3. 图像分析处理系统进行辉度扫描,并以 GAPDH 校正作相对量分析,数值以两者之积分吸光度的比值表示。PCR 产物测序:扩增好的目的基因的 PCR 产物 (50ul) 进行测序。我的试验计划,请多提意见,谢谢。
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电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?
电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?不会没成功吧?
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双非博士真就如大家所说没有出路?
双非博士一枚,在老师的指导下,自己也算勤奋,发了三四篇SCI,其中有一篇顶刊,手头上还有一些工作没有处理完,本来心里有些自卑,面对现在外界所说双非博士的各种言论,导致自己有些不知所措。以后进高校,哪怕你有好文章也是会四处碰壁嘛?想问问过来人的经验。
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PCR有产物但是电泳无结果
PCR后用紫外分光测定DNA含量都在450-500ug/ul,但电泳无目的片段的条带,内参也没条带。电泳中maker能跑出条带,用引物也点了样,引物的条带稍模糊但还是有,请问是哪里出了问题?
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