RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制性片段长度多态性)是一种较早的进行 SNP 分型的技术,简单来说就是在包含 SNP 位点的序列中存在有特定的限制性内切酶酶切位点,而 SNP 位点基因型的改变则会使该酶切位点失效,这样根据酶切之后 PCR 片段长度的多态性即可得知对应的基因型,下面用一张图片来示意该方法的实验流程:
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF MS)技术的 SNP 分型原理是:先通过 PCR 扩增目标序列,然后加入 SNP 序列特异延伸引物,在 SNP 位点上延伸 1 个碱基。将制备的样品分析物与芯片基质共结晶,将该晶体放入质谱仪的真空管, 而后用瞬时纳秒(10 - 9s)强激光激发,基质分子吸收辐射能量,导致能量蓄积并迅速产热,使基质晶体升华,核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子,产生的离子多为单电荷离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能,进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率的不同得以分离,在真空小管中飞行到达检测器。
MALDI 产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测,离子质量越小,就越快到达。利用质谱分析对质量的灵敏度特别高的特点,很容易将仅含有一个不同碱基的两段基因序列区别开,推导出 SNP 分型。
缺点:对于 SNP 位点两侧序列要求较高,存在特殊序列,如 SNP 位点,插入缺失等会影响准确性,另外,对于样本质量稍微有些高,补数据较为麻烦,如果样本质量不是很好的,建议谨慎选用;最后一点是检测成本低是基于位点数以及样本数较多的情况而言,目前市面上的公司一般是 25 - 30 个位点一个体系,384 孔板为一个反应收费。
Taqman 荧光探针法
Taqman 探针想必各位都不陌生,原理介绍如下:
该技术是由 ABI 研发的 SNP 分型技术,其技术原理如下:PCR 反应时,加入一对两端有不同荧光标记的 MGB 特异探针来识别不同等位基因(allele1 和 allele2),5’端为报告荧光基团(reporter),3’端为淬灭荧光基团 (quencher)。PCR 过程中,两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。当探针以完整形式存在时,由于能量共振转移,荧光基团只发出微弱荧光。
LDR 法是基于核酸特异杂交原理,设计两条 3' 端碱基不一样的鉴别引物用以鉴别 SNP 位点的两种 Allele,同时设计一条在位点另一侧的通用的引物,在高温连接酶的作用下,当左右两条寡核苷酸探针(鉴别引物以及通用引物)与目的 DNA 序列完全互补,并且两条探针之间没有空隙时才能发生连接反应,通过温控循环该特异性连接反应可反复进行,达到线性扩增的效果,最后通过荧光扫描片段长度(在通用引物的合成时已经在一端进行了荧光修饰),实现对 SNP 位点的检测。
iMLDR 技术是基于传统的连接酶反应经过改进后的多重 SNP 分型技术,相比于传统的连接酶反应技术,iMLDR 提高了准确性和分型的成功率,该方法的特色在于采用了一个双连接反应,将区分基因型的荧光使用连接方法加到连接产物上,这样一来可以轻松的增加该分型方法的通量。
重新绘制了下该方法的原理图,分型方法的原理图上已经描述的很清楚啦:
优点:准确性较于 LDR 来说有了一定的提升,检测通量较高。
缺点: LDR 一样,对于位点的选择性较高。
基因芯片法
DNA 基因芯片技术是近年来新开发的一种 DNA 序列变异检测工具,其原理是利用目标 DNA 与支持物上所固定的密集的寡核苷酸探针阵列进行等位基因特异性反应,根据反应信号的有无和强弱确定 SNP 位点。
近年来随着复杂性疾病研究的深入,以及可利用的基因组数据的增加,基于各种原理的 SNP 芯片反应被开发出来,以适应不同目的、规模和条件的基因分型,那么市面上现在常见的基因芯片 Illumina SNP 芯片分型平台(包括 Infinium®技术和 GoldenGate®技术)和 Affymetrix 基因分型平台(Affymetrix GeneTitan®技术),这两大公司的基因分型平台是目前应用最为广泛的基因分型平台,适用于大样本不同标记密度的快速基因分型。
这里由于商品化芯片种类有很多,就不单独介绍,有需要的同学可以去各家公司的官网上进行查询,这里主要介绍一下这两家的芯片的制造区别:Illumina 的技术为微珠技术,将 DNA 探针序列偶联到微珠的表面,再将各种微珠均匀的撒在已经通过光蚀刻技术蚀刻出很多微孔的玻璃基片上,而 Affymetrix 的技术则是直接在玻璃载体表面通过光蚀刻的方法植上探针序列,具体的技术细节这里就不做赘述了。
SNPSCAN 分型法
SNPSCAN 分型法采用连接酶连接反应的高特异性实现对 SNP 位点等位基因的识别,然后通过在连接探针末端引入不同长度的非特异性序列以及通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物,利用标记荧光的通用引物对连接产物进行 PCR 扩增,通过荧光毛细管电泳扩增产物进行电泳分离,最后通过 GeneMapper 软件分析获取各个 SNP 位点的基因型。
重绘了一下原理图,帮助大家理解这种方法:
优点:通量足够大,原理上来说可以一次性检测 48n 个位点。
缺点:对于位点的要求更高,比 LDR 的要求更高,因为该方法检测的只有位点两侧的几十 bp 序列,如果这部分的序列存在着比较特殊的结构或者很高的同源性,那么基本可以告别这种方法了。