实时荧光定量PCR具体实验步骤
1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③ ...
来源:互联网 114948 阅读
荧光定量PCR:简介,原理,应用
荧光定量PCR检测技术诞生至今已10多年的时间,而其应用一直都没广泛展开,究其原因,无外乎受制于相关仪器、试剂和技术的发展。近期,尤其是08年以来,仪器和试剂是遍地开花,这也使科研人员均跃跃欲试,都想借此技术使自己的研究能突飞猛进,发展势头通过查找每年所发表的文章数可一目了然。据有关统计,在 Medline 数据库中,用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作为关键词检索,1996 年是19 篇,1999 年157 篇,到2003 年就高达2984 篇 ...
来源:互联网 92098 阅读
利用实时定量PCR分析基因相对表达量
2-△△CT方法是相对定量real-time PCR的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导,假设及其应用。本文还介绍了两种2-△△CT衍生方法的推导和应用及它们在实时定量PCR在的运用。
来源:互联网 66362 阅读
QPCR常见问题及其分析
一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度 ...
来源:丁香园 57383 阅读