关键词: 荧光定量PCR
来源: 丁香园论坛
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从1996年美国Applied Biosystems公司推出实时荧光定量PCR技术以来,该技术已经越来越广泛的应用到各类RNA的研究中,成为研究RNA必不可少的实验手段之一。目前比较常用的方法有两种:
(1)TaqMan荧光探针法:该方法在特异性探针的两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时,荧光基团发光被淬灭基团吸收;在PCR扩增过程中,探针被降解,荧光基团与淬灭基团分离,发出可被检测到的荧光,以此来监测整个PCR过程。
(2)SYBR荧光染料法:该方法利用了SYBR Green荧光染料非特异性与双链DNA结合并发光的特性,检测PCR的全部进程,从而判定初始RNA的量。
成熟的miRNA大小只有22nt左右,在用实时荧光定量PCR检测miRNA时,难点在于如何识别如此小的miRNA并合成第一链。目前常用的用于识别并合成miRNA第一链的方法主要有颈环法和加尾法两种。
(1)颈环法原理图
近年来,研究人员发现了越来越多的miRNA,其中有很多miRNA序列相近,有的仅仅只有一个碱基差异。这些不同的miRNA虽然序列相近,但是也有着不同的来源及功能。上述两种方法虽然解决了miRNA的识别及后续PCR问题,但是无法分辨这些只有一个或者两个碱基差异的miRNA。
美国Signosis推出的新方法,使用多对寡核苷酸对目的miRNA进行识别,单个碱基差异就可以破坏寡核苷酸与靶标序列的结合,从而分辨单个碱基差异的miRNA;同时该方法不用进行方转录,避免了反转录过程中出现错配的可能;同时,这个新方法还引入了磁珠分离技术,在进行PCR前,通过结合有链霉亲和素的磁珠对特异性标记有生物素的靶标序列进行纯化,大大提高了特异性。
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电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?不会没成功吧?
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双非博士真就如大家所说没有出路?
双非博士一枚,在老师的指导下,自己也算勤奋,发了三四篇SCI,其中有一篇顶刊,手头上还有一些工作没有处理完,本来心里有些自卑,面对现在外界所说双非博士的各种言论,导致自己有些不知所措。以后进高校,哪怕你有好文章也是会四处碰壁嘛?想问问过来人的经验。
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PCR有产物但是电泳无结果
PCR后用紫外分光测定DNA含量都在450-500ug/ul,但电泳无目的片段的条带,内参也没条带。电泳中maker能跑出条带,用引物也点了样,引物的条带稍模糊但还是有,请问是哪里出了问题?
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