关键词: RT-PCR PCR
来源: 丁香园论坛
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--PCR/RT-PCR疑难问题解答1.问题:RT-PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因:1)RNA被降解建议解决方法:在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA;在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA;如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且,在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT。2)RNA中包含逆转录抑制剂建议解决方法:通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元(0.25μg到0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复。逆转录抑制剂包括:SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。3)多糖同RNA共沉淀建议解决方法:使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火建议解决方法:确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligo(dT)或随机六聚体.确定GSP是反义序列。5)起始RNA量不够建议解决方法:增加RNA量。对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。6)RNA模板二级结构太多建议解决方法:将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃。注意:不要在>60℃时使用oligo(dT)引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃。注意:不要在高于37℃时使用M-MLV。如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物。7)引物或模板对残余的RNA模板敏感建议解决方法:在PCR前用RNaseH处理。8)靶序列在分析的组织中不表达建议解决方法:尝试其他靶序列或组织9)PCR没有起作用建议解决方法:对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。2.问题:PCR灵敏度:在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。可能原因:1)PCR引物设计较差建议解决方法:避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。2)DNA含有抑制剂建议解决方法:诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA。3)富含GC的模板建议解决方法:对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution。4)模板浓度太低建议解决方法:使用104拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号。5)镁离子浓度太低建议解决方法:从1mM到3mM,间隔0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意:对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度。6)退火温度太高建议解决方法:使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些。7)引物浓度太低建议解决方法:最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。3.问题:RT-PCR特异性:在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。 可能原因:1)物和模板非特异性退火建议解决方法:在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。2)GSP设计较差建议解决方法:遵循用于扩增引物设计的同样原则3)RNA中沾染了基因组DNA建议解决方法:使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。4.问题:PCR特异性:在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。可能原因:1)形成引物二聚体建议解决方法:设计在3'端没有互补序列的引物。2)引物和模板非特异性退火建议解决方法:以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间。在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度。使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。3)镁离子浓度太高建议解决方法:对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。4)因为扩增复杂模板导致引物错误起始建议解决方法:使用巢式PCR或递减PCR。5)沾染外源DNA建议解决方法:使用抗气雾剂的tip和UDG。6)因为二级结构导致引物结合位点无法接近建议解决方法:对于GC含量>50%的模板,使用(1×-3×)PCRx Enhancer Solution。5.问题:PCR忠实性:PCR在产物序列中引入了错误 可能原因:1)聚合酶忠实性低建议解决方法:使用带有校正活性的热稳定聚合酶,如Platinum Pfx DNA聚合酶。2)循环数太多建议解决方法:降低循环数。3)四种dNTP的浓度不同建议解决方法:制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同。使用预混合物
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电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?
电泳时条带跑出凝胶,是什么情况?不会没成功吧?
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双非博士真就如大家所说没有出路?
双非博士一枚,在老师的指导下,自己也算勤奋,发了三四篇SCI,其中有一篇顶刊,手头上还有一些工作没有处理完,本来心里有些自卑,面对现在外界所说双非博士的各种言论,导致自己有些不知所措。以后进高校,哪怕你有好文章也是会四处碰壁嘛?想问问过来人的经验。
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PCR有产物但是电泳无结果
PCR后用紫外分光测定DNA含量都在450-500ug/ul,但电泳无目的片段的条带,内参也没条带。电泳中maker能跑出条带,用引物也点了样,引物的条带稍模糊但还是有,请问是哪里出了问题?
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