你可能提过很多质粒 却不一定知道这些

你可能提过很多质粒 却不一定知道这些

关键词: 质粒

来源: 生物学霸

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经常提质粒吗?熟练之后,提质粒乃至质粒构建都很简单。但如果真问起一些质粒的细节,可能很多人回答不了。不信随我看看。

质粒组成要素

一个合格的质粒含有以下组成部分:

复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

抗生素抗性基因 可以便于加以检测,如 Amp+ 、Kan+。

多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段

P/E 启动子/增强子

Terms 终止信号

加 poly(A)信号 可以起到稳定 mRNA 作用

如何阅读质粒图谱

第一步:首先看 Ori 的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)。

第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。

Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。

tetr 可以阻止四环素进入细胞。

camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。

neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶 使 G418(长那霉素衍生物)失活

hygr 使潮霉素β失活。

第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步:再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说,外源 DNA 片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。

第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。

启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号

启动子-促进 DNA 转录的 DNA 顺序,这个 DNA 区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是 DNA 分子上可以与 RNApol 特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。

增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,负调控序列。

核糖体结合位点/起始密码/SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是 AUG(起始密码)和 SD 序列。

转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列,此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富丰区,这 2 部分共同构成 poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个 AATAAA 的保守序列,此位点 down-stream 有一段 GT 或 T 富丰区,这 2 部分共同构成 poly(A)加尾信号。

为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条 DNA 链,即质粒是环状双链 DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上。

如何选择载体

把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。

P.S. 基因工程所用的 vector 实际上是 DNA 分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的 DNA。

选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述 3 点:

1. 构建 DNA 重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体。

2. 载体的类型:

克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb 选质粒。

表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。

对原核表达载体应该注意 3 点:选择合适的启动子及相应的受体菌;用于表达真核蛋白质时注意克服 4 个困难和阅读框错位;表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

3. 载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不产生阅读框架错位。

选用质粒(最常用)做载体的 4 点要求:

选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5 kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);

一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般 10 个以上的拷贝,而严谨型质粒 < 10 个。

必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;

必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr(试一试)。

无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体 DNA 进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。

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经验交流

  • 第一次离心后出现黑色物体,后面连续做了两次,都有,不知道是哪个环节出现了问题,严格的无菌操作

      4 评论

  • PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题

    我的表达载体是pTwin1,目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切,连接,转化入T克隆菌,菌液验证,测序,测序正确;从该菌中提取重组质粒,转化表达菌BL21,菌液验证,然后1:100接种摇菌至OD600为0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度诱导,分别1小时,2小时,3小时,4小时,过夜取样,跑SDS-PAGE,看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签,但我用酶已经切掉了一个,所以他自身只带有一个大约24KD的标签,加上我的目的片段一3KD,大小应该为27KD左右;目的片段二25KD,大小应该为49KD。 我想问 :我的目的蛋白测序正确但好像没表达,怎么回事呢?我已经做了2个月了,很急,请大家帮忙看看,谢谢了。  目的片段一:1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)该目的蛋白应在27KD处表达,但仔细看好像没有表达。

      3 评论

  • 构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白

    换了不同浓度的IPTG,用不同温度,不同诱导时间都做了,但都没有我的蛋白,菌落PCR,双酶切,测序都是对的,为什么不表达呢?

      3 评论

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