细胞转染实验

细胞转染实验

关键词: 细胞转染 脂质体 外源质粒

来源: 互联网

21414 阅读

一、实验目的

学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法,观测外源蛋白的表达(绿色荧光蛋白),为染色准备实验材料。

二、实验原理

上图所示是脂质体介导转染的示意图,它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。

外源基因进入细胞主要有四种方法:电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入;磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞;病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大;病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响;所以现在对于很多普通细胞系,一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性,因此脂质体与质粒的比例,细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题,通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。

本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂,它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物,是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。

三、实验材料与器材

1、材料

293T细胞

MyoD表达质粒和EGFP表达质粒

DMEM培养基

链霉素/青霉素(双抗)

FCS(小牛血清)

PBS(磷酸盐缓冲溶液)

胰酶/EDTA消化液

转染试剂(TransFast

超方便的实验干货查询工具

微信扫码进入「丁香实验」小程序

经验交流

  • 第一次离心后出现黑色物体,后面连续做了两次,都有,不知道是哪个环节出现了问题,严格的无菌操作

      4 评论

  • PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题

    我的表达载体是pTwin1,目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切,连接,转化入T克隆菌,菌液验证,测序,测序正确;从该菌中提取重组质粒,转化表达菌BL21,菌液验证,然后1:100接种摇菌至OD600为0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度诱导,分别1小时,2小时,3小时,4小时,过夜取样,跑SDS-PAGE,看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签,但我用酶已经切掉了一个,所以他自身只带有一个大约24KD的标签,加上我的目的片段一3KD,大小应该为27KD左右;目的片段二25KD,大小应该为49KD。 我想问 :我的目的蛋白测序正确但好像没表达,怎么回事呢?我已经做了2个月了,很急,请大家帮忙看看,谢谢了。  目的片段一:1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)该目的蛋白应在27KD处表达,但仔细看好像没有表达。

      3 评论

  • 构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白

    换了不同浓度的IPTG,用不同温度,不同诱导时间都做了,但都没有我的蛋白,菌落PCR,双酶切,测序都是对的,为什么不表达呢?

      3 评论

  • 发表经验交流

    版权声明

    我的询价

    询价列表

    暂时没有已询价产品

    inquiry icon 快捷询价
      当你希望让更多商家联系你时,可以勾选后发送询价,平台会将你的询价消息推荐给更多商家。
      个人收货地址

      编辑个人收货信息

      yanxuan

      关注「丁香通研选」

      微信及时获得商家回复,

      获得更多交易信息和保障。

      丁香实验小程序

      微信关注
      丁香实验

      意见反馈