关键词: 葡聚糖转染 DEAE 细胞转染
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DEAE-葡聚糖介导的转染,其原理还不清楚,可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核,此法只适合暂时转染实验,转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系,可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时间(30分钟-1.5小时),又可用较低浓度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用较长时间(8小时)。
方法如下:
1. 接种鼠L成纤维细胞浓度为5×105CO2 /孔/皿生长2~3天,当达50%板底面积可用。
2. 乙醇沉淀的4μg的PSV2-neo质粒DNA,空气干燥后溶于40μL的TE中,或取供体DNA。
3. 用10ml 1×PBS、4mL、10%富合生长因子血清的DMEM洗板(皿)。
4. 在80μl热的10g/L DEAE-葡聚糖中缓慢加入DNA,取120μL DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)细胞中,使其分布均匀轻轻转动直到显示均匀一致的红色,培养4小时。
5. 从孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖,加入5mL 10%DMSD,室温放置1分钟,吸出DMSO,用5mL 1×PBS洗一次吸出,加入10mL培养液(10%血清的DMEM)。
6. 培养细胞,在适当时间分析细胞,若含有抗药基因,可用G418选择培养液培养。
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第一次离心后出现黑色物体,后面连续做了两次,都有,不知道是哪个环节出现了问题,严格的无菌操作
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PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题
我的表达载体是pTwin1,目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切,连接,转化入T克隆菌,菌液验证,测序,测序正确;从该菌中提取重组质粒,转化表达菌BL21,菌液验证,然后1:100接种摇菌至OD600为0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度诱导,分别1小时,2小时,3小时,4小时,过夜取样,跑SDS-PAGE,看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签,但我用酶已经切掉了一个,所以他自身只带有一个大约24KD的标签,加上我的目的片段一3KD,大小应该为27KD左右;目的片段二25KD,大小应该为49KD。 我想问 :我的目的蛋白测序正确但好像没表达,怎么回事呢?我已经做了2个月了,很急,请大家帮忙看看,谢谢了。 目的片段一:1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)该目的蛋白应在27KD处表达,但仔细看好像没有表达。
3 评论
构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白
换了不同浓度的IPTG,用不同温度,不同诱导时间都做了,但都没有我的蛋白,菌落PCR,双酶切,测序都是对的,为什么不表达呢?
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