关键词: 重组子 筛选 鉴定
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PCR 鉴定重组子
重组子可通过酶切进行鉴定,也可以利用扩增引物通过 PCR 进行鉴定,阳性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的 PCR 产物。
1. 用牙签挑取平板上的菌落接种于 2ml 含适当抗生素的 LB 培养基中,37℃摇 床培养过夜。
2. 次日取菌液 0.2-0.5ml,13,000rpm×3min 离心,弃上清,加入 20μl ddH2O 和 20μl 酚/ 氯仿,震荡混匀,13,000rpm×5min 离心。
3. 取上清进行琼脂糖电泳,加入载体质粒 DNA 作为阴性对照,根据质粒大小 初步筛选重组子,重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。
4. 用碱法小量制备可能是重组子的质粒 DNA。
5. 选取适当的酶,对重组子进行酶切分析,酶切体积均为 10μl 体系。酶切样品 进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。
6. 酶切分析正确的重组子分成两份,一份进行测序反应,另外一份保种。
7. 若用 PCR 法鉴定,则在第 2 步时每个样本取 0.5-1.0μl 菌液为模板进行 PCR 反应,每管反应体系最低可少至 10μl ,PCR 产物电泳,能得到所需条带的样 本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。
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第一次离心后出现黑色物体,后面连续做了两次,都有,不知道是哪个环节出现了问题,严格的无菌操作
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PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题
我的表达载体是pTwin1,目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切,连接,转化入T克隆菌,菌液验证,测序,测序正确;从该菌中提取重组质粒,转化表达菌BL21,菌液验证,然后1:100接种摇菌至OD600为0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度诱导,分别1小时,2小时,3小时,4小时,过夜取样,跑SDS-PAGE,看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签,但我用酶已经切掉了一个,所以他自身只带有一个大约24KD的标签,加上我的目的片段一3KD,大小应该为27KD左右;目的片段二25KD,大小应该为49KD。 我想问 :我的目的蛋白测序正确但好像没表达,怎么回事呢?我已经做了2个月了,很急,请大家帮忙看看,谢谢了。 目的片段一:1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)该目的蛋白应在27KD处表达,但仔细看好像没有表达。
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构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白
换了不同浓度的IPTG,用不同温度,不同诱导时间都做了,但都没有我的蛋白,菌落PCR,双酶切,测序都是对的,为什么不表达呢?
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