关键词: 重组子 检测
来源: 丁香园
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[ 实验目的 ] 通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。 通过本实验学习重组质粒的检测技术。 [ 基本原理 ] 聚合酶链反应( polymerase chain reaction , PCR )是体外酶促合成特异 DNA 片段的一种技术。在待扩增的 DNA 片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物,经变性、退火和延伸若干个循环后, DNA 扩增 2 n 倍。 PCR 进行的基本条件是: ( 1 )以 DNA 为模板(在 RT - PCR 中模板是 RNA ); ( 2 )以寡核苷酸为引物; ( 3 )需要 4 种 dNTP 作为底物; ( 4 )有 Taq DNA 聚合酶。 PCR 每一个循环由三个步骤组成: ( 1 )变性 加热模板 DNA ,使其解离成单链; ( 2 )退火 降低温度,使人工合成的寡聚核苷酸引物在低温条件下与模板 DNA 所需扩增序列结合; ( 3 )延伸 在适宜温度下, Taq DNA 聚合酶利用 dNTP 使引物端向前延伸,合成与模板碱基序列完全互补的 DNA 链。 每一个循环产物可作为下一个循环的模板,因此通过 35 个循环后,目标 DNA 片段可能性扩增可达 2 35 倍。 [ 器材 ] 1 . PCR 扩增仪 2 .掌式离心机 3 . 0. 2ml PCR 管 [ 试剂 ] 1 . Taq DNA 聚合酶 2. 10×PCR 反应缓冲液 3. 2. 5 mmol/L dNTP 4. 50 mmol/L MgCl 2 5. 模板 DNA 6. 上游引物 7. 下游引物 8. 标准 DNA [ 实验步骤 ] 1. 以质粒 DNA 为模板进行 PCR 扩增。 PCR 反应总体积为 20 μl ,反应液组成:2. PCR 反应程序设定为: 94℃ ,预变性 5 min ; 94℃ 变性 1 min , 66℃ 退火 30 s , 72℃ 延伸 1 min ;共进行 35 个循环;最后 72℃ ,延伸 10 min 。 3. 扩增完毕,取 10 μL 用 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增结果。
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第一次离心后出现黑色物体,后面连续做了两次,都有,不知道是哪个环节出现了问题,严格的无菌操作
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PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题
我的表达载体是pTwin1,目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切,连接,转化入T克隆菌,菌液验证,测序,测序正确;从该菌中提取重组质粒,转化表达菌BL21,菌液验证,然后1:100接种摇菌至OD600为0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度诱导,分别1小时,2小时,3小时,4小时,过夜取样,跑SDS-PAGE,看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签,但我用酶已经切掉了一个,所以他自身只带有一个大约24KD的标签,加上我的目的片段一3KD,大小应该为27KD左右;目的片段二25KD,大小应该为49KD。 我想问 :我的目的蛋白测序正确但好像没表达,怎么回事呢?我已经做了2个月了,很急,请大家帮忙看看,谢谢了。 目的片段一:1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)该目的蛋白应在27KD处表达,但仔细看好像没有表达。
3 评论
构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白
换了不同浓度的IPTG,用不同温度,不同诱导时间都做了,但都没有我的蛋白,菌落PCR,双酶切,测序都是对的,为什么不表达呢?
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