关键词: 菌种 保藏
来源: 互联网
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基因克隆菌种保藏
1、实验简介
基因克隆 菌种 的保藏一般采用冷冻保藏的方法.一般是将菌种于-20℃或-80℃以下的温度保藏,通过冷冻,使菌体 代谢 活动停止.在保藏的时候,通常在培养物中加入一定的冷冻保护剂(如甘油).
实验中使用的主要仪器:
超净工作台 -20℃柜式冰箱 -80℃超低温冰箱
2、实验前准备
超净工作台照射紫外灭菌30分钟后,点燃里面的酒精灯,用酒精棉球擦拭台面,保证严格无菌操作.
3、菌种保存
过夜培养的 大肠杆菌 都要先进行菌种保存已被后用.取数个1.5ml 灭菌的EP管,做好标记,先加入灭过菌的甘油,再加入菌液混匀,最终制备成15%甘油菌;为了避免外来菌种的污染,一般最后要用封口膜对EP管封闭.
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第一次离心后出现黑色物体,后面连续做了两次,都有,不知道是哪个环节出现了问题,严格的无菌操作
5 评论
PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题
我的表达载体是pTwin1,目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切,连接,转化入T克隆菌,菌液验证,测序,测序正确;从该菌中提取重组质粒,转化表达菌BL21,菌液验证,然后1:100接种摇菌至OD600为0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度诱导,分别1小时,2小时,3小时,4小时,过夜取样,跑SDS-PAGE,看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签,但我用酶已经切掉了一个,所以他自身只带有一个大约24KD的标签,加上我的目的片段一3KD,大小应该为27KD左右;目的片段二25KD,大小应该为49KD。 我想问 :我的目的蛋白测序正确但好像没表达,怎么回事呢?我已经做了2个月了,很急,请大家帮忙看看,谢谢了。 目的片段一:1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)该目的蛋白应在27KD处表达,但仔细看好像没有表达。
3 评论
构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白
换了不同浓度的IPTG,用不同温度,不同诱导时间都做了,但都没有我的蛋白,菌落PCR,双酶切,测序都是对的,为什么不表达呢?
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