关键词: 电穿孔 感受态细胞 大肠杆菌
来源: 互联网
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材料和试剂
1. 恒温旋转式摇床
2. 三角烧瓶(容量为1或2L)
3. 50ml灭菌离心管
4. 低温高速离心机
5. SB培养基
细菌培养用胰化蛋白胨 20g
细菌培养用酵母提取物 5g
NaCl 0.5g
去离子水 950ml
250mmol/L KCl溶液 10ml
以5N的NaOH调节溶液的pH值至7.0,加去离子水至1L,高压蒸气灭菌。
6. 20%葡萄糖溶液
7. 1mol/L MgCl2溶液
8. 10%甘油
操作步骤
1. 从新鲜的LB平板培养物中挑选一个TG1克隆,接种于10m1 SB培养基中。
2. 37℃摇床培养过夜。
3. 取2.5ml培养物转接于0.5L SB中,另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。
4. 37℃培养直到OD600=0.7~0.8。
5. 将培养物置于冰浴15min,然后4000r/min于4℃离心20min,弃上清。
6. 将菌体重悬于1/2体积的预冷10%甘油中,4000r/min于4℃离心20min,弃上清。
7. 重复第(6)步骤。
8. 将菌体重悬于15ml 10%甘油,并转移至一支50ml的离心管中。3500r/min于4℃离心15min。小心地去掉上清,得到4~5ml细菌。迅速地将其吹打重悬;
9. 分装成200μl或40μl 的小份,操作应在乙醇/干冰浴中进行。贮存于-70℃。
10. 用pUC19质粒测试制备感受态细菌的转化效率,应达到109cfu/μg DNA。
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第一次离心后出现黑色物体,后面连续做了两次,都有,不知道是哪个环节出现了问题,严格的无菌操作
5 评论
PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题
我的表达载体是pTwin1,目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切,连接,转化入T克隆菌,菌液验证,测序,测序正确;从该菌中提取重组质粒,转化表达菌BL21,菌液验证,然后1:100接种摇菌至OD600为0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度诱导,分别1小时,2小时,3小时,4小时,过夜取样,跑SDS-PAGE,看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签,但我用酶已经切掉了一个,所以他自身只带有一个大约24KD的标签,加上我的目的片段一3KD,大小应该为27KD左右;目的片段二25KD,大小应该为49KD。 我想问 :我的目的蛋白测序正确但好像没表达,怎么回事呢?我已经做了2个月了,很急,请大家帮忙看看,谢谢了。 目的片段一:1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)该目的蛋白应在27KD处表达,但仔细看好像没有表达。
3 评论
构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白
换了不同浓度的IPTG,用不同温度,不同诱导时间都做了,但都没有我的蛋白,菌落PCR,双酶切,测序都是对的,为什么不表达呢?
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感受态细胞 E.coli HB101,用于电穿孔
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