关键词: 感受态 DNA 构建质粒
来源: 诺唯赞
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刚进实验室,师兄就神秘兮兮的对我说,「小师妹啊,师兄我最近要做一项非常伟大的研究,非常需要你的协助。」我:「(星星眼)好哇,要我做什么?」师兄:「听好了啊,师兄我要将扩增好的启动子序列重组到载体中,再将这个重组 DNA 分子导入细菌体内进行表达喔,是不是非常伟大?」我:「(继续星星眼)嗯嗯」师兄:「这个艰巨的任务现在就交给你啦,很简单的,你先做个感受态出来,再将我构建的质粒转进去就好了。"我:「..........(感受态是什么鬼,能吃吗?)」感受态小科普野生型的细菌由于能产生一种酶,可以迅速降解进入的外源 DNA,所以并不容易转化。而所谓的感受态,就是指受体最易接受外源 DNA 片段并实现其转化的一种生理状态,受受体的遗传性状、菌龄、外界环境因子的影响。受体细胞经过一些特殊方法 (如:电击法、CaCl2 等化学试剂法) 处理后, 使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源 DNA 分子通过的感受态细胞。进入细胞的 DNA 分子通过复制、表达,实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。听说大肠杆菌转化常用的是化学法 ( CaCl2 法),我赶紧在网上下载了 protocol,检查了一下实验室现有的试剂和设备,开动试验!首先将 -70℃ 甘油保存的菌种取出来,用划线法接种细菌于培养皿,37℃ 培养过夜。第二天,挑取单克隆,接种至 5 ml LB 培养液中,37℃ 震荡培养过夜。第三天,取 1 ml 菌液接种至 100 ml LB 培养基中,37℃ 震荡培养约 2~3 小时(200~300r/min)。将培养瓶取出,放置冰上 10-15 分钟。4℃ 离心(4000 g)10 分钟。弃上清,将离心管倒置于干滤纸上 1 min,吸干残留的培养液。加 10 ml 0.1M 的 CaCl2 到离心管中,振荡混匀,悬浮菌体,冰浴 30 分钟。4℃ 离心(4000 g)10 分钟,弃上清,将管倒置于干滤纸上 1 min,吸干残留的培养液。加 4 ml 冰预冷的 0.1M 的 CaCl2,重悬浮菌体。每管 0.2 ml 分装,至 -80℃ 保存备涂板,长斑,赶紧报告师兄。师兄:「额,这是什么斑,师妹,这里面准是染上杂菌了吧。整个操作过程都要在无菌条件下进行,所有的器材包括水都要经过高压灭菌的,要不你再试试?」重新紫外杀菌,高压灭菌后,继续划线摇菌,加 CaCl2,分装涂板,没长斑,赶紧报告师兄。师兄:「淡定,测了 OD 值没,是多少?」我:「啊?什么 OD 值?」师兄:「......」重复划线摇菌,测 OD600,0.8。师兄:「过了,不超过 0.5,已经对数期。没事啊,再做一遍,你一定行的。」划线摇菌,测 OD,还好在 0.3 左右,离心,加 CaCl2,分装。赶紧涂板,没长斑。师兄:「额,师妹,要不我们从难度低一点的实验做起?先去跑个 PCR 怎么样?」我:「那你的的伟大研究怎么办?"师兄:「没事,听说诺唯赞的感受态转化效率≥108 cfu/μg pUC19 DNA,而且他们家细胞口碑不错价格也可以接受,就用他们家的吧!」我:「好啊好啊,师兄你真好!」我:「老板,师兄说买个感受态。」感受态细胞制备不易,且用且珍惜!
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第一次离心后出现黑色物体,后面连续做了两次,都有,不知道是哪个环节出现了问题,严格的无菌操作
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PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题
我的表达载体是pTwin1,目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切,连接,转化入T克隆菌,菌液验证,测序,测序正确;从该菌中提取重组质粒,转化表达菌BL21,菌液验证,然后1:100接种摇菌至OD600为0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度诱导,分别1小时,2小时,3小时,4小时,过夜取样,跑SDS-PAGE,看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签,但我用酶已经切掉了一个,所以他自身只带有一个大约24KD的标签,加上我的目的片段一3KD,大小应该为27KD左右;目的片段二25KD,大小应该为49KD。 我想问 :我的目的蛋白测序正确但好像没表达,怎么回事呢?我已经做了2个月了,很急,请大家帮忙看看,谢谢了。 目的片段一:1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)该目的蛋白应在27KD处表达,但仔细看好像没有表达。
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构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白
换了不同浓度的IPTG,用不同温度,不同诱导时间都做了,但都没有我的蛋白,菌落PCR,双酶切,测序都是对的,为什么不表达呢?
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