RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法
第一节 概 述 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链将双链cDNA和载体连接然后转化扩增 即可获得cDNA文库构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克隆问世 ...
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RNA干扰的详细实验步骤
步骤包括:(一)siRNA的设计1. 在设计RNAi实验时,可以先在以下网站进行目标序列的筛选:GenesilAmbion2. RNAi目标序列的选取原则:(1)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始,寻找“AA”二连序列,并记下其3'端的19个碱基序列,作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非 ...
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RNA提取时的一些常见问题分析
一、用Trizol 抽提的RNA,用琼脂糖凝胶电泳,出现许多条带(至少四条以上),是哪些原因导致的?参考见解:1、是从组织里抽的还是细胞抽的?组织的RNA电泳不理想,但目的条带仍能跑出来。细胞的电泳相当漂亮,但有时逆转录效果反而不好。组织经常出现这种情况,组织抽提的RNA不纯,而且多多少少有降解。不过下一步可以接着做逆转录,可能对后面的实验影响不会很大。2、是mRNA的话,这样的效果挺不错的。如果 ...
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miRNA、siRNA、dsRNA与shRNA 表示什么意思?
siRNA,shRNA,dsRNA,miRNA间的区别RNA干扰(RNAi),即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA(siRNA)代替传统反义核酸进行转录后基因沉默,已经迅速而广泛地应用到基因功能,基因表达调控机制研究等热门领域,并为基因治疗开辟了新的途径。近两年来,这方面的科学论文及报道爆炸性增长,几乎每天都有新的结果涌现。这些论文中,出现了很多与RNA干扰相关的概念,意思很相近但并不完全相同,这里列举了几个常见 ...
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