关键词: 甲醛 变性电泳 检测 RNA 完整性
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一、材料、试剂和仪器
1、材料:植物总RNA 5-10μg
2、试剂:
1)加样运载缓冲液(Loading buffer)50% 甘油1mmol/L EDTA (pH 8.0)0.25%溴酚蓝25%二甲苯氰FF
2)10×TAE Buffer
3)5×甲醛凝胶电泳缓冲液:0.1mol/L MOPs (pH7.0)40mmol/L乙酸钠5mmol/L DETA(pH8.0)
4)甲醛,甲酰胺
3、仪器:电泳装置,紫外透射观测仪
二、实验程序
1、甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制
在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose (Sigama),再加20mL 10×TAE Buffer,144mLDEPC处理过的双蒸水,微波炉中化胶,待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛,放置一段时间以减少甲醛蒸汽。
2、RNA的甲醛变性电泳
1) 样品制备RNA总量10μg5×甲醛凝胶电泳缓冲液4μl甲醛 3.5μl甲酰胺10μl
加入无菌离心管中混合,95℃水浴变性2min(或55℃,15min),取出后放入冰中冷却。
2) 加入2μl无菌的DEPC处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三: 增大样品密度,以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,便于加样操作;能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置。以 0.5 X TBE作电泳液时,溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同,而二甲苯氰FF 的泳动速率与长4kb 的双链线状DNA相同。)
3)将胶板浸没在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中,点样前5V/cm预跑5min。点样后3-4V/cm电泳。
4)电泳结束后(溴苯酚蓝迁移到约8cm处),紫外灯下观察, 照相。
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