然而,目前的研究清楚地显示miRNAs表达与多种人类恶性肿瘤相关,提示它们代表着一种新型癌症生物标记信号。在特定癌症中找出相关的miRNA,能够提供给我们有用的诊断信息,从而为疾病分类,以及制定出可行的治疗方案打下基础。
产生机制及分子学功能
miRNAs产生过程的第一步(Liu et al., 2008):在RNA聚合酶Ⅱ介导下转录生成一条长的原始miRNA分子,称为pri-miRNAs 。此前体物在细胞核中被所谓的微处理器切割,这种微处理器由RNA聚合酶III的主要成分Drosha和双链RNA结合蛋白即称为DGCR8/Pasha的辅助因子组成,在其剪接下形成长约70nt的具有茎环结构的中间体,称为前体miRNA(pre-miRNAs)。随后pre-RNA由核内转移到胞质,RNA聚合酶III的核酸内切酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA:miRNA双链。接下来miRNA的装载过程为miRNA:miRNA双链展开,成熟的miRNA结合于Argonaute (Ago)蛋白。大多数的情况下,miRNA被降解,而miRNA/Ago则形成miRNP复合物的核心成分,介导miRNA的功能发挥。
miRNA下调基因表达发生在转录后水平(Liu et al., 2008)。miRNP复合物与特异的mRNA通过碱基配对相互作用,其二者的结合位点在mRNA的3’端非翻译区,他们的Ago结合蛋白就沉积在mRNA靶点处。miRNA通过去稳定作用或者核内裂解mRNA介导翻译阻抑,这种阻抑作用依赖于miRNA与靶mRNA之间的互补性。miRNA确切的分子功能也依赖于Ago蛋白动员。
如果与Ago2蛋白结合的成熟miRNA,与靶mRNA完全互补结合,则引起靶mRNA的降解(在植物中比较常见)。mRNA裂解片段通过细胞旁路被清除,而剩下完整的miRNA。靶mRNA的分裂是miRNA调节的优化机制(Jones-Rhoades et al., 2006),动物miRNAs有减退靶蛋白水平的趋势而无核内裂解mRNA(Filipowicz et al., 2005)。另外,成熟的miRNA与只有部分互补序列的靶mRNA结合,随后的翻译抑制可能发生在起始、延长或终止阶段,但是详细机制仍待阐明(Wu and Belasco, 2008)。由于完全互补的靶结合能力不同,每个miRNA可以结合于多种不同的靶基因发挥不同的功能,从而调节多种编码基因。详细的miRNA靶点预测仍然是一个挑战,但是已有许多生物信息手段应用于成熟miRNA序列的前2-8个核苷酸即所谓的“miRNA种子”来进行预测。目前,Vasudevan等人指出,多种miRNAs不仅能抑制翻译,而且也能增强翻译,是抑制还是增强翻译依赖于细胞周期所处状态。
miRNAs在癌症中起重要作用
miRNAs充当基因调节器作用,能够调控细胞生长、分化和凋亡。在许多人类肿瘤病例中,都发现miRNA表达异常,要么是在成熟的miRNAs,要么是在前体miRNAs,或者二者皆有。因此,miRNAs表达水平的改变在肿瘤形成中也起重要作用。与正常组织相比,虽然在肿瘤组织中大多数miRNAs表达都下降,但是也有高表达的miRNAs被发现。鉴于此,miRNA基因被认为既充当肿瘤抑制基因也充当癌基因角色(Zhang et al., 2007)。
例如,研究发现肺癌病人的miRNAs let-7表达水平降低(Takamizawa et al., 2004)。在动物体内,let-7的表达依赖于动物的生长发育周期,在发育早期let-7低表达,而分化成熟的组织let-7高表达。下调let-7的表达水平致使分化失败,从而导致了癌症的发生。另外,实验表明,RAS癌基因是miRNA let-7的直接靶点,说明在肺癌发生过程中,let-7通过调节RAS的表达发挥抑癌基因作用。第二种情况,通过作用于抗凋亡基因BCL2靶点,下调miR-15和miR-16在慢性淋巴瘤的表达。另一方面,致癌的miRNAs通过负调控抑制抑癌基因或调节细胞分化或细胞凋亡,从而促进肿瘤生长。例如,miR-17-92在许多癌症如肺癌或淋巴瘤的表达明显增加,它的形成可以增加肺癌细胞的生长。进一步研究表明,到目前为止,参与肿瘤形成的miRNAs中,至少50%的miRNAs基因定位于癌症相关基因组区域(Calin et al., 2004)。
通过研究miRNAs表达谱来进行癌症分类
基于miRNAs表达谱研究,我们可以就肿瘤发育形成和分化程度对其进行分类。较传统的基于mRNA表达研究的分类方法,具有更高的精确度(Lu et al., 2005; Rosenfeld et al., 2008)。在包含多种人类癌症的系统性研究中,几乎所有的miRNAs都显示出不同的表达,这使得将其用以鉴定不同发育起源的肿瘤成为可能。这种人类癌症的分类方法,通过测定相关的大约200条小数量miRNAs的表达来完成,而如果通过mRNA基因表达方法的话,即使使用几千个mRNA也不能得到同样结果。另外研究显示,miRNAs的表达与特异的病理学特点如肿瘤期或增殖指数具有强相关性。相比之下,由于mRNA转录后修饰发生在从DNA转变成蛋白质的过程中,因此,其表达谱常常不能直接得出生物学或者具有临床意义的结果,而miRNAs能较为直接的反映基因功能水平。
使用miRNAs为肿瘤分类的另外一个巨大益处:将大大改善临床研究中常规收集保存的,通过福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织的稳定性。较长的mRNAs在甲醛固定和加工处理期间最可能被降解和化学修饰。而miRNAs很小,蛋白质又受RISC络合物的保护,故其固定方法较持久,能够长期保持。通过广泛的Snap Frozen Cells研究发现,使用FFPE样本做miRNAs表达谱具有很高的可靠性(Li et al., 2007)。