从靶基因起始密码子 AUG 下游 50~100 个核苷酸开始搜寻理想的 siRNA 序列,越靠近靶基因的 3′端,其基因沉默效果可能越好。
2. siRNA 序列的起始碱基与长度
SiRNA 序列最好为 AA(N n)UU(N 代表任意碱基;n 为碱基数目,在 19~29 nt 之间), NA(N n) UU 和 NA(N n) NN 序列也可以。最新研究表明 ,27 nt 或 29 nt 的 siRNA 与 21 nt siRNA 相比 27 nt SiRNA 对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下得到。
3 .siRNA 3′端突出碱基的选择
建议用 dTdT 取代 3′端的 2 个碱基突出,增强 siRNA 双链复合体的稳定性。
4 .siRNA 序列中 G/ C 含量的选择
G/C 含量在 30%~52% 的 siRNA 序列,其沉默基因效果较好。
5 .siRNA 中应避免连续的单一碱基和反向重复序列
因为连续 2 个以上的 G 和 C 可以降低双链 RNA 的内在稳定性,从而抑制 RNAi 作用;连续 3 个以上的 U 和 A 可能终止由 RNA Polymerase III 介导的转录。siRNA 序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构,这种结构的存在可以降低 siRNA 的有效浓度和沉默效率。
6 .siRNA 双链的内在稳定性
反义链 5端的第一个碱基尽量为 A 或 U;siRNA 正义链的 5端第一个碱基尽量为 G 或 C。
7. siRNA 正义链的碱基偏爱性
正义链的第一位和第十九位碱基为 A; 正义链的第十位碱基为 U; 正义链的第十三位碱基不为 G; 正义链的第十九位碱基不为 G 或 C 时,siRNA 序列具有较高的基因沉默效率。