ChIP 技术的原理:1)通过甲醛将染色质上的 DNA 和目的蛋白交联,2)通过超声或酶解的方法将染色质片段化,3)包含有目的蛋白的染色质片段通过抗体富集纯化,4)通过加热解除 DNA 和目的蛋白的交联,5)通过蛋白酶和 RNA 酶消化去除目的染色质的蛋白和 RNA 之后,将目的 DNA 纯化出来。6)得到的 DNA 可以通过 PCR 检测目标区域的 DNA 是否被目的蛋白富集,或者通过 DNA 测序的方式检测目的蛋白在全基因组上的分布[5]。
以超声为例,打断后的 DNA 片段大小以 200~1 000 bp 为宜。DNA 片段太大,一方面影响 IP 效率,更重要的是会影响 ChIP 的分辨率。DNA 片段太小虽然理论上能得到更高的分辨率,但也会影响后续的 qPCR 和建库。另外,需要注意的是,超声是通过物理的作用力将 DNA 的共价键打断,从而实现染色质片段化。其在破碎 DNA 的同时,也会在一定程度上破坏目的蛋白以及目的蛋白和 DNA 之间的相互作用。所以,超声摸索应遵循适可而止的原则。
IP 的另外一个关键因素是 buffer,这包括 binding buffer(超声用 buffer)和 wash buffer。因为组蛋白与 DNA 的结合比较牢固,所以相对来说组蛋白修饰的 ChIP 更容易做,对 buffer 的要求也不是太严格。但是对于很多转录因子来说,因为本身跟 DNA 不是特别紧密(很多都是动态结合),在同一染色质区域,只有很少部分细胞可以捕获到目的蛋白和 DNA 的结合,所以通过合适的 buffer 将目的蛋白结合的 DNA 与背景 DNA 区分并分离出来就显得很关键了。一般来说,选用的 Buffer 越剧烈,背景 DNA 去除的就会越干净,但同样的,目的 DNA 也会被更多的清洗掉。反之,选用的 buffer 越温和,目的 DNA 得到的就会越多,但同样的,背景 DNA 也就残留的越多。对于去垢剂来说,离子型去垢剂(如 SDS,SDC)比非离子型去垢剂剧烈得多。对于盐来说,剧烈程度 LiCl > NaCl > KCl。去垢剂的选择,盐和去垢剂的浓度都会对 ChIP 效果产生很大影响。很多实验室或公司在这方面都有自己独到的 buffer 配方。
最后,除了以上关键的两个因素之外,为了降低背景,很多实验会在两个地方做优化:1,在超声破碎之前,首先破碎胞浆,通过离心将胞浆胞核分离,去除胞浆蛋白,降低胞浆蛋白干扰。2,用超声后的染色质与 protein A/G beads 预孵育,在去除 beads 之后再加入鲑精 DNA 预封闭过的 protein A/G beads 和目的蛋白抗体进行孵育。(根据个人的经验,这两点优化可能能降低背景,但是并不是 ChIP 成功与否的关键。当然对于与染色质结合不强的蛋白的 ChIP 或少量的细胞的 ChIP,降低背景就比较必要了)。
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5. Kuo, M.H. and C.D. Allis, In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods, 1999. 19(3): p. 425-33.
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