【共享】酶切原理及步骤
酶切基础知识酶切DNA酶切一般分为质粒直接酶切和PCR产物酶切。DNA酶切及凝胶电泳一.DNA的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从 ...
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【共享】双酶切
1、 在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近,必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的,则必须先切,否则就可能造成酶切失败。2、 回收PCR产物:回收的PCR产物片段=1:10 ,一般取前者0.03pmol,后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA:(X pmoles×长度bp×650)/ 1,000,000 (注:长度bp× ...
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质粒构建之酶切位点的选择
结论:一定要选择具有相同buffer的两个酶技术背景:克隆目的基因,并把其装入表达载体转化/转染原核细胞/真核细胞中,是获取目的蛋白/研究基因功能的经典方法,也是目前科研工作者常用的方法。其中酶切是该技术不可缺少的一部分,随着载体设计技术的发展,双酶切以其独特的优点而逐渐取代了单酶切 。具体实验流程如下:设计合成含有酶切位点,能扩增基因ORF全长的一对引物——PCR扩增目的基因——纯化PCR产物——分别对PCR产物及载 ...
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双酶切连接反应之全攻略
前一阵子一直在做双酶切质粒重组,失败了 很多次,不过很快改善了 实验方法,用2周重组了 14个质粒。现就自己的体会,结合丁香园战友的宝贵经验,谈一下质粒重组的一些个人经验。1. 回收PCR产物在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的 选择非常重要,尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如BamHI、HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位 ...
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