重组克隆筛选(酶切鉴定)
【实验目的】1.掌握质粒提取的基本方法的原理;2.学习和掌握限制性内切酶的使用方法。【实验原理】重组克隆的筛选和鉴定是基因工程中的重要环节之一。不同的克隆载体和相应的宿主系统,其重组克隆的筛选和鉴定方法不尽相同。从理论上说,重组克隆的筛选是排除自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的DNA片断插入的载体所形成的克隆。常用的筛选方法有两类。一类是针对遗传表型改变筛选法,以β-半乳糖苷酶系 ...
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【共享】酶切常见问题与原因及解决办法!
问题:原因解决办法DNA完全没有被内切酶切割:1) 内切酶失活标准底物检测酶活性2) DNA不纯,含有SDS,酚,EDTA等内切酶抑制因子将DNA过柱纯化,乙醇沉淀DNA3) 条件不适(试剂、温度)检查反应系统是否最佳4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解,重新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌株5) DNA酶切位点上没有甲基化(如Dpn I)换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA(如S ...
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DNA酶切及凝胶电泳
第一节 概 述 一. DNA的限制性内切酶酶切分析 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA,而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性 ...
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DNA重组
简单介绍了DNA重组技术的一些方法。包括重组质粒、PCR等。
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