关键词: 双酶切
来源: 丁香园论坛
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加分作为鼓励,因为有的问题还需要继续讨论!谢谢!第一次做双酶切连接有90%连接成功率(挑了24个克隆),重复性也不错。兴奋之余,相与丁香园各位战友一起分享经验,因为以前得到了许多帮助。
准备:目的片段PCR产物胶回收,用乙醇沉淀法纯化胶回收产物,
并经紫外分光光度计计算其浓度(A)
质粒同样经乙醇沉淀法纯化,测定纯化产物的浓度(B)
酶切:目的片断和质粒分别进行双酶切,大约10单位酶能完全切断1μg
左右的DNA片断
(A/B) 1 μg
酶1 0.5 μL
酶2 0.5 μL
10*通用buffer 2 μL
加ddH2O 补足到20 μL
37℃酶切1.50h,尽量使其酶切完全。
限制性内切酶的灭活:将酶切反应管直接放入 65℃水浴,15min无需进行胶回收,将酶灭活后的酶切反应物直接用于连接反应,但是有一点非常重要,就是计算好插入量和载体的连接摩尔比,因为没有进行胶回收纯化,会有一些小片段干扰连接反应,如载体自连等,目的片段的摩尔数大于载体的3~6倍,会大大减少这些干扰的出现,实践证明这是非常重要的。
连接:连接反应前将目的片段的酶切反应液a和载体片断的酶切反应液b放入50℃水浴中5min,减少自连产生。根据连接反应摩尔比,计算加入的a和b的量分别为:a1和b1,在加入1μLT4ligasa 和1μLbuffer,加水补足到10μL。混匀后,4℃放过夜。希望各位看后能指出其中的不足,也能有所收获。
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小树洞:你们工作后第一个月都得了多少工资呢?
妇产专硕18年刚毕业,四证合一。找了个市级三甲医院,合同的。工作一个月,当时发工资,968元。之前应聘的时候说前三月试用期1300 元。试用期过后加奖金,没想到,呵呵,租房一月1000元。今天直接崩溃。打算明天打电话问财务扣的都是什么钱,了解清楚后闪人。回家继承祖业—烤地瓜,烤玉米走起。你们工作后第一个月都得多少工资呢?
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抗体保存
用奶粉或者BSA配好的一抗/二抗可以在—20度保存多久?大约几个星期还是一两个月?
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DNA提取有杂带
PCR产物用试剂盒回收的时候,发现有杂带?有哪些办法可以提取得更干净?
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