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科研福利:载体构建实验常见问题大解析

关键词: 载体构建 PCR 线性化所用载体 连接反应 菌落PCR鉴定 2019-01-09 16:00 来源:海创科业生物 点击次数:2275

大家是否在实验中经常遇到载体构建的各种问题,浪费大量的时间和精力,各种各样的问题让人头疼,海创科业小编作为科研老司机特意为各位科研君整理了载体构建实验常见问题及解决方法,希望能够帮助到大家。

1. PCR

载体构建大部分时候都要通过PCR的方法获取目的片段,扩增PCR的时候大家尽量选用高保真的PCR酶来进行扩增,扩增之前我们首先要了解目的基因序列信息。其次高质量的模板对PCR成功与否也很重要,以质粒作为模板的PCR相对来说最好扩增,基因组DNA和cDNA相对来说较难获取一些。

引物设计工作,一般很多软件都可以进行引物设计,例如pirmer5之类的软件。除了常用的酶切连接的方法也可以使用无缝克隆的方法构建,选用哪种方法我们都要在引物设计的时候考虑到,酶切连接的方法和无缝克隆引物设计注意点如下:

1) 无缝克隆方法设计引物的时候要加入同源重组臂序列。

2) 做酶切连接引物设计要注意加上保护碱基,保护碱基大部分加入4个碱基可以满足大多数内切酶,也可以参照限制性内切酶保护碱基添加表加保护碱基。

在扩增前我们应了解目的片段是否有高GC、或者重复序列之类的特殊序列,还有片段长度都会影响实验,不推荐一次构建片段5K以上的实验,如果片段过长我们可以通过拆分目的片段来分步构建。

一定要注意要设计好之前的用到的内切酶位点的设计,片段长度的增加与实验难度是成正比的,如果你的目的片段含有高GC序列,可以加入DMSO之类的辅助剂增加PCR的扩增效率,现在市面上针对高GC等特殊结构的PCR酶也很多,大家也可以用此类的酶扩增,扩增好PCR要进行纯化回收,此步不多讲,一般胶回收试剂盒都能满足要求。

2. 线性化所用载体

很多人习惯先构建到T载体再进行下一步的构建,其实基本直接构建到最终载体成功率也非常高,以下一些注意事项希望能帮大家节省时间直接省略T载体构建一步成功。

线性化载体的时候,最好验证过载体是没有问题的,通常我们单酶切或双酶切的时候要注意内切酶的buffer是否没有用错,一般根据说明书再延长一些时间会使线性化更加彻底,增加载体构建的阳性率,

3. 连接反应

一般载体与目的片段的比例推荐1:1到1:4,使用nanodrop进行定量,通常根据紫外灯通过亮度对比也是可以的,连接反应的时候最好在冰上操作,此步要操作轻柔,载体和片段连接酶之类的加入要混匀,PCR上机反应

4. 转化

转化实验要保证感受态细胞的转化效率,通常实验要求转化之后要加入培养基进行复苏,海创科业小编大量经验验证可以不必复苏,直接涂板,无论是amp抑菌类的抗生素或者kana杀菌类的抗生素都是可以直接涂板的。涂板之后37℃过夜培养即可。

5. 菌落PCR鉴定

做菌落PCR鉴定的时候引物一般选择载体上的通用引物来鉴定,因为选用目的片段两端的引物可能会出现假阳性;操作方法一般挑取单克隆在小的EP管培养4小时左右,培养基出现浑浊的情况即可以进行菌落PCR鉴定,鉴定完成后一般送三四个送测序验证即可,pcr过程可能会发生突变,所以多送几个克隆可以保证我们所要的克隆顺利获得。

以上是本次分享所有内容,如有其他问题或没有考虑到的地方欢迎大家联系海创科业小编。

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